Biosynthesis, solubilization and purification of human membrane bound catechol-O-methyltransferase in brevibacillus choshinensis cells

• Autor(a) principal: Pedro, Augusto Quaresma Henriques
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/2499
• topic: Proteínas membranares; Proteínas - Produção heteróloga; MBCOMT humana; Doença de Parkinson; Domínio/Área Cientifica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química

As proteínas membranares constituem cerca de 20 a 30 % de todas as proteínas codificadas pelo genoma de vários organismos. Elevadas quantidades de proteínas num estado de elevada pureza são necessárias quer para estudos farmacológicos, quer para estudos cristalográficos, daí a imperativa necessidade de desenvolver novos sistemas para a sobre-expressão heteróloga de proteínas membranares. Especificamente, nós testámos a aplicação de Brevibacillus choshinensis para a biosíntese da isoforma membranar da catecol-Ometiltransferase humana. No que diz respeito ao processo de produção, obteve-se uma moderada a elevada expressão num meio complexo com um valor de 45 nmol/h/mg para a actividade biológica da hMBCOMT, atingida às 20 horas de cultura a 37 ºC e 250 rpm. No que diz respeito à solubilização da proteína alvo, a eficiência de reconstituição para a hMBCOMT é nula na presença de detergentes iónicos tais como o SDS. No entanto, a aplicação de baixas concentrações de detergentes não-iónicos parece ser ideal para solubilizar a fracção membranar visto que a hMBCOMT recombinante retém elevados valores para a actividade biológica. Dos detergentes testados, a digitonina a 0.5 % (m/v) parece ser o mais adequado. De facto, o método descrito nesta tese é simples e poder-se-á tornar muito útil se aplicado num diagrama global para o isolamento da MBCOMT tendo em vista a sua caracterização bioquímica ou biofísica, onde se destaca a determinação da sua estrutura por cristalografia de raios-X ou estudos de interacção da hMCOMT com inibidores.