The role of GRIM-19 and STAT3 interaction in renal tumorigenesis
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| Data de Publicação: | 2012 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/7660 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 |
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The role of GRIM-19 and STAT3 interaction in renal tumorigenesisCancroCarcinoma de células renaisBiologia molecularProteínasTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012GRIM-19 is a gene that encodes a 16-kDa protein originally identified as a critical regulatory protein for interferon (INF)-ß and retinoic acid (RA)-induced cell death. It was also demonstrated that GRIM- 19 is involved in mitochondrial metabolism, as an integrant component of complex I of the mitochondrial respiratory chain (MRC). GRIM-19 appears, therefore, as a dual function protein involved in cell death and mitochondrial metabolism. Moreover, GRIM-19 downregulation was observed in all subtypes of renal cell carcinomas (RCC), particularly in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC), in contrast with thyroid tumors in which GRIM-19 downregulation is specifically associated with oncocytic tumors (Hürthle cell tumors, mitochondrion-rich), suggesting a role for GRIM-19 in tumorigenesis. As GRIM-19 binds and inhibits the signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3), which has been shown to be activated and playing a major role in several human tumors, it is tempting to advance that GRIM-19 may function as a tumor suppressor in those tumors. Recently it was reported that STAT3 is located in mitochondria and it appears to be involved in the regulation of mitochondrial metabolism. Thus, it is necessary to clarify if and how the interaction between GRIM-19 and STAT3 proteins interferes with main function of mitochondria: energy production and cell death regulation. The aim of this work was to investigate the potential role of GRIM-19 as a tumor suppressor gene by studying its interaction with STAT3 protein and by clarifying the mechanism (s) responsible for its downregulation and lack of GRIM-19 expression in RCC, particularly in ccRCC. Blocking GRIM-19 expression using a specific short hairpin RNAs (shRNA) in ccRCC derived cell lines (Caki-2 and 786-O) and in a human embryonic kidney cell line (HEK 293), we observed that GRIM-19 downregulation leads to an increase of phosphorylated STAT3, thereby increasing STAT3 activity in tumoral cells but not in non tumoral cells. Our data suggests that GRIM-19 expression, in RCC, is regulated through a repressive mechanism by transcription factors. We hypothesize a model of how GRIM-19 and STAT3 interaction could be linked with their dual functions and their cellular localization. GRIM-19 and p-STAT3Ser727 interaction in mitochondria may have a determinant role in ccRCC tumorigenesis but it needs further investigations. Overall, we conclude that GRIM-19 and STAT3 interaction has a relevant role in renal tumorigenesis. In contrast with thyroid, GRIM-19 may have a broader role in kidney tumorigenesis playing a major role in cell morphology and cell metabolic remodeling.O GRIM-19 é um gene que codifica uma proteína de 16kDa originalmente identificada como sendo importante na regulação da morte celular induzida por interferão e ácido retinóico. Posteriormente foi também demonstrado que a proteína GRIM-19 é parte integrante do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial (CRM) participando no processo da fosforilação oxidativa. Deste modo, a proteína GRIM-19 parece exercer uma dupla função na célula, estando envolvida na regulação da morte celular e no metabolismo mitocondrial. Foi observada uma subexpressão em todos os sub-tipos de carcinomas de células renais (CCR), nomeadamente no carcinoma de células claras renais (CCCR), contrariamente aos tumores de tireóide, onde a subexpressão da proteína GRIM-19 está especialmente associada a tumores de tireóide com características oncocíticas (com células Hürthle -caracterizadas pela presença de um elevado número de mitocôndrias), sugerindo assim um papel do gene/da proteína GRIM-19 na tumorigénese. Uma vez que a proteína GRIM-19 se liga e inibe o transdutor de sinal e activador de transcrição-3 (STAT3), o qual está ativado em muitos tumores humanos, é possível que o GRIM-19 funcione como gene supressor tumoral em tumores nos quais a proteína STAT3 desempenhe um papel importante. Por outro lado, foi recentemente descrito que a proteína STAT3 se pode também localizar na mitocôndria regulando a atividade dos complexos I e II da CRM e por conseguinte, o metabolismo celular. Assim, é necessário esclarecer se e como a interação destas duas proteínas interfere nas principais funções da mitocôndria: produção de energia e regulação da morte celular. O principal objectivo deste trabalho foi investigar o papel do GRIM-19 como potencial gene supressor tumoral, nomeadamente através da sua interação com a proteína STAT3 na tumorigénese renal e ao mesmo tempo, identificar e perceber quais os mecanismos responsáveis pela sua subexpressão e/ou ausência de expressão da proteína GRIM-19 em CCR, particularmente em CCCR. Bloqueando a expressão de GRIM-19 usando um “short hairpin” RNAs (shRNA) específico em linhas celulares derivadas de CCCR (Caki-2 e 786-O) e numa linha renal embrionária humana (HEK-293), observámos que a subexpressão da proteína GRIM-19 tem efeitos distintos em células tumorais e não-tumorais, quer em termos de remodelação metabólica quer quanto à forma como a proteína GRIM-19 interage com a proteína STAT3. Nos clones de 786-O shGRIM-19 a subexpressão da proteína GRIM-19 levou a uma alteração metabólica, tornando as células mais glicolíticas (maior consumo de glucose e maior produção de lactato e aumento de expressão da enzima glicolítica HK II e do transportador de glucose GLUT1). Contudo, nas linhas celulares HEK não observámos esse efeito, mas sim menor expressão das proteínas glicolíticas. Através de ensaios de imunofluorescência e avaliação do potencial de membrana (JC- 1), observámos que a subexpressão da proteína GRIM-19 implica uma reorganização ao nível do citoesqueleto da célula, assim como da sua rede mitocondrial; também se confirmou que a subexpressão da proteína GRIM-19 provoca um decréscimo da actividade mitocondrial a nível do complexo I da CRM. Assim, a proteína GRIM-19 parece ter um papel mais abrangente na tumorigénese renal. Os resultados deste trabalho permitiu-nos também propor um possível mecanismo pelo qual a expressão da proteína GRIM-19 é regulada em CCR. Inicialmente, verificámos que as linhas renais tumorais 786-O e Caki-2 tinham uma expressão distinta da proteína GRIM-19, a qual não se devia a mutações genéticas. Para além disso, realizámos Real-time PCR para fazer uma quantificação relativa de GRIM-19 mRNA, que mostrou também não haver qualquer tipo de alteração a nível transcripcional. Contrariamente, ao “alternative splicing” descrito por outros autores, obtivémos um transcripto normal do exão 1ao 5 com cerca de 402bp. Tendo em conta muitos estudos que identificaram que, em tumores de células renais, a maioria dos genes supressores tumorais estão subexpressos devido à hipermetilação do promotor, iniciámos uma análise do estado de metilação da provável região do promotor do gene GRIM-19 nas linhas Caki-2 e 786-O. Verificámos que a linha celular 786-O, a que tinha menor expressão da proteína GRIM-19, era a tinha uma fracção mais hipermetilada. Procedemos então a um tratamento de desmetilação com 5Aza-dC para ver se ocorria um aumento de expressão da proteína GRIM-19. Surpreendentemente, por Real-Time PCR, confirmou-se a análise prévia por Western blot, que mostrou que a linha celular 786-O não sofreu alterações mas que a linha celular Caki-2 sofreu um decréscimo de cerca de 50% de expressão do GRIM-19.Ao mesmo tempo, também por Real-Time PCR, observou-se um aumento muito significativo do STAT3 mRNA, particularmente na linha celular 786-O. Adicionalmente, procedemos a uma análise de um fragmento de ilhas CpG para tentar identificar quantas e quais as ilhas CpG que estavam metiladas. Verificamos que as linhas celulares tinham padrões de metilação distintos. Apesar de não se ter usado um método quantitativo do grau de metilação, poderemos afirmar que a linha celular Caki-2 mostrou evidências de estar mais metilada e que com o tratamento de desmetilação algumas ilhas identificadas mostram uma perda significativa desse padrão de metilação. Todos estes resultados demonstram que a subexpressão da proteína/gene GRIM-19 em CCCR estará associada à hipermetilação do seu promotor (verificado por dois métodos diferentes). Sugerimos ainda que a transcrição do gene GRIM-19 poderá estar sob a regulação de um mecanismo de repressão por acção de factores de transcrição, dado que, na região do promotor estudada, existem locais de ligação de vários factores de transcrição, incluindo o STAT3. Este trabalho permitiu-nos também idealizar um modelo de interacção entre as proteínas GRIM-19 e STAT3 e como esta pode estar relacionada com a dupla função das mesmas e a sua localização celular. Serão necessários mais ensaios para confirmar a colocalização destas proteínas na mitocôndria e a sua interacção, bem como para saber se a presumível localização do p-STAT3Ser727 na mitocôndria, observada aquando de um ensaio de fraccionamento celular, poderá ser devida a um mecanismo de compensação em consequência da indução da subexpressão de uma subunidade do complexo I da CRM, GRIM-19. Em conclusão, como já fora publicado, confirma-se que a subexpressão de GRIM-19 em CCCR não é justificada por mutações ou alterações a nível transcripcional. Por outro lado, o estado de metilação da hipotética região do promotor do gene GRIM-19 por si só também não explica porque é que a linha celular Caki-2 tem uma expressão maior do que a linha celular 786-O. Contudo, os resultados deste trabalho levantam pela primeira vez a hipótese de que a região do promotor do gene GRIM-19 estará hipermetilada e que poderá existir um mecanismo de repressão por factores de transcrição a regular a transcrição do GRIM-19 em CCCR. Por último, a interacção do GRIM-19 em particular com o p- STAT3Ser727 pode ter um papel determinante na tumorigénese de CCCR mas ainda são necessárias mais investigações para confirmar esta hipótese. Os resultados deste trabalho sugerem que proteína /gene GRIM-19 terá um papel mais abrangente na tumorigénese de CCCR e também revelaram várias evidências de que este assunto merece um desenvolvimento mais aprofundado devido a uma potencial contribuição para terapias antineoplásicas.Máximo, ValdemarCrespo, Ana Maria Viegas, 1946-Repositório da Universidade de LisboaDias, Ana Isabel Mendes, 1989-2013-02-06T17:33:07Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/7660enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:51:04Zoai:repositorio.ul.pt:10451/7660Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:25.821304Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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