Molecular identification and environmental screening for members of the Vibrionaceae family

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Leal, Inês Filipa Cabral
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/19248
Resumo: Bacteria of the Vibrio genus are one of the most abundant and diverse prokaryotes in aquatic environments, comprising well-known opportunistic pathogens that infect human and marine animals, and are responsible for human foodborne diseases and disease outbreaks in aquaculture systems. Currently, the risk of infection by Vibrio is rapidly increasing because of climate change effect on the ocean and thus characterization of novel strains and the development of technologies for their early detection are essential for management and to minimize their impact. In this study, seven marine Vibrio isolates from infected sole (Solea senegalensis) and their bathing waters were characterised using microbiological, biochemical, and molecular techniques. Colony morphology, growth, and activity of putative virulence-secreted enzymes were determined under optimal and stress conditions (modified pH and salinity). All isolates had different colony morphologies and sequencing of 16S rRNA fragment (> 1400 bp) revealed they are likely non-described strains. All isolates grew at 22ºC, but only the isolates of V. parahaemolyticus and V. harveyi, which are potential human pathogens, grew at 37 ºC. All isolates are antibiotic sensitive although Amikacin was ineffective. Proteolytic and hydrolytic assays revealed that V. parahaemolyticus and the two V. harveyi isolates had different enzyme activities at 22 and 37 ºC. Culture under decreased salinity (0.75% NaCl) and modified pH (7.8 and 8.2) caused a significant (p < 0.05) increase in their growth and enzymatic activity and revealed the capacity for environmental adaptability. A multiplex PCR (5-plex) targeting different Vibrio species was developed but was inefficient for use with environmental samples. Our results highlight that a large variety of Vibrio spp. remains to be characterised and indicated that culture conditions modify growth and most likely virulence.
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spelling Molecular identification and environmental screening for members of the Vibrionaceae familyVibrioAgentes patogénicosCaraterização microbiológicaAtividade bioquímicaDeteção molecularDomínio/Área Científica::Ciências Médicas::Outras Ciências MédicasBacteria of the Vibrio genus are one of the most abundant and diverse prokaryotes in aquatic environments, comprising well-known opportunistic pathogens that infect human and marine animals, and are responsible for human foodborne diseases and disease outbreaks in aquaculture systems. Currently, the risk of infection by Vibrio is rapidly increasing because of climate change effect on the ocean and thus characterization of novel strains and the development of technologies for their early detection are essential for management and to minimize their impact. In this study, seven marine Vibrio isolates from infected sole (Solea senegalensis) and their bathing waters were characterised using microbiological, biochemical, and molecular techniques. Colony morphology, growth, and activity of putative virulence-secreted enzymes were determined under optimal and stress conditions (modified pH and salinity). All isolates had different colony morphologies and sequencing of 16S rRNA fragment (> 1400 bp) revealed they are likely non-described strains. All isolates grew at 22ºC, but only the isolates of V. parahaemolyticus and V. harveyi, which are potential human pathogens, grew at 37 ºC. All isolates are antibiotic sensitive although Amikacin was ineffective. Proteolytic and hydrolytic assays revealed that V. parahaemolyticus and the two V. harveyi isolates had different enzyme activities at 22 and 37 ºC. Culture under decreased salinity (0.75% NaCl) and modified pH (7.8 and 8.2) caused a significant (p < 0.05) increase in their growth and enzymatic activity and revealed the capacity for environmental adaptability. A multiplex PCR (5-plex) targeting different Vibrio species was developed but was inefficient for use with environmental samples. Our results highlight that a large variety of Vibrio spp. remains to be characterised and indicated that culture conditions modify growth and most likely virulence.A família Vibrionaceae inclui diversos géneros extremamente importantes nos ecossistemas marinhos, entre eles o género Vibrio. Este género é caraterizado por bactérias Gram-negativas móveis (devido à presença de um flagelo polar), anaeróbias facultativas e quimiorganotróficas, que existem na forma livre na coluna de água, nos sedimentos ou em associação com organismos aquáticos através do estabelecimento de relações de comensalismo. As bactérias do género Vibrio têm um papel essencial no equilíbrio do ecossistema marinho e na recirculação do carbono orgânico. Em consequência do seu curto tempo de duplicação (geralmente 10-20 minutos), as espécies de Vibrio crescem a uma vasta gama de temperaturas, pH e salinidade. De entre as mais de 100 espécies de Vibrio já identificadas, apenas uma parte constitui perigo para o ecossistema marinho e para a saúde humana através do consumo de peixe e mariscos crus ou pouco cozinhados, sendo responsáveis por surtos de infeções (vibrioses) com impacto na Saúde Pública. As espécies de Vibrio podem ser agentes patogénicos primários, causando geralmente infeção mesmo em hospedeiros saudáveis, ou patogénicos oportunistas. Neste caso, algumas espécies que fazem parte da microbiota dos organismos saudáveis poderão encontrar as condições de crescimento ideais em caso de diminuição da imunidade do hospedeiro ou disbiose, levando a uma possível infeção. Em aquacultura são responsáveis por diversos surtos e elevadas perdas económicas, afetando particularmente as fases larvares dos organismos marinhos. Existem pelo menos 12 espécies classificadas como agentes patogénicos humanos, nomeadamente V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. mimicus, V. alginolyticus e V. cholerae. Estas espécies poderão infetar o hospedeiro através da via oral ou por contacto com a pele. Infeções por estas espécies de Vibrio são extremamente rápidas e os sintomas variam em função do agente infecioso, a via de entrada e condição imunitária do hospedeiro. A sua capacidade infeciosa advém de fatores de virulência como as estruturas de adesão, mobilidade ou produção de enzimas que causam lesões no hospedeiro e permitem a sua proliferação. Alterações das características físico-químicas do meio aquático como temperatura, salinidade e pH, causadas pelas alterações climáticas, têm um papel importante na dinâmica das interações patogénicohospedeiro- ambiente. Estas alterações têm sido observadas ao longo das últimas décadas e prevê-se que sejam ainda mais proeminentes no futuro, com drásticas modificações no ecossistema marinho. As bactérias e a sua interação com o hospedeiro são modificadas pelas condições ambientais, com particular ênfase nos membros do género Vibrio onde o aquecimento dos oceanos e mudanças de salinidade e pH favorecem o crescimento das estirpes patogénicas. Este trabalho teve como objetivo a identificação e caraterização de sete isolados correspondentes a cinco possíveis espécies de Vibrio, isoladas a partir da água dos sistemas de aquacultura e do fígado de linguado (Solea senegalensis) infetado cultivado em sistemas de recirculação de água. Os isolados de Vibrio caracterizados incluem cinco potenciais estirpes patogénicas (V. parahaemolyticus, duas estirpes de V. harveyi e duas de V. ichthyoenteri) e dois isolados não patogénicos (V. renipiscarius e V. alfacsensis). Após a confirmação da pureza dos isolados e a sua morfologia em Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS), os mesmos foram identificados através da amplificação do gene 16S rRNA e comparação das sequências nucleotídicas com a base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI). O crescimento em TCBS, a sua cinética de crescimento e produção de enzimas proteolíticas e hidrolíticas (esterásica e lipolítica) relacionadas com o seu potencial de virulência foram analisados a 22 (temperatura de referência das zonas costeiras) e 37 ºC (temperatura de referência do corpo humano no início de uma infeção). O efeito das condições de cultura, nomeadamente a diminuição em 25% da salinidade e o pH (8.2- referência do meio marino; 7.8- diminuição de 0.4 do pH marinho prevista) na cinética de crescimento e atividade enzimática dos isolados também foi analisada para prever, em condições laboratoriais, qual o impacto das alterações climáticas nos oceanos no crescimento e potencial virulência dos isolados. Por fim, foi desenvolvida uma ferramenta molecular com base na amplificação do DNA genómico por PCR para detetar simultaneamente as cinco espécies de Vibrio (5-plex) em amostras ambientais. A amplificação do gene 16S rRNA resultou em fragmentos com cerca de 1465 pares de bases cuja sequência de nucleótidos foi comparada com a base de dados do NCBI. Os resultados indicam que os sete isolados pertencem ao género Vibrio. No entanto, a percentagem de identidade obtida para cada isolado indica que poderá tratar-se de novas estirpes ainda não caraterizadas. Todos os isolados crescem a 22 ºC, mas só os isolados de V. parahaemolyticus (Vpa) e V. harveyi (Vha1 e Vha2) crescem a 37ºC. Todos os isolados demonstram sensibilidade a todos os antibióticos testados, exceto para a amicacina, cuja suscetibilidade se restringiu aos isolados V. renipiscarius e V. ichthyoenteri 2. Ensaios enzimáticos realizados em placas de agar suplementadas com os substratos específicos (gelatina, Tween 20 e Tween 80) demostraram que só os isolados V. parahaemolyticus e V. harveyi apresentaram atividade enzimática a 22 e 37 ºC, observando-se um aumento significativo do crescimento dos três isolados a 37ºC, tal como um aumento da atividade proteolítica e esterásica do isolado V. harveyi 1. Alterações das condições de cultura afetaram a cinética de crescimento dos isolados de forma distinta. Com a diminuição da salinidade (0.75% NaCl) observou-se um aumento significativo (p < 0.05) do crescimento dos isolados V. alfacsensis e V. ichthyoenteri. Quando cultivados a pH mais baixo apenas o crescimento dos isolados V. alfacsensis, V. renipiscarius, V. ichthyoenteri 1 e V. harveyi 1 diminuiu de forma significativa (p < 0.05). Os três isolados com atividade enzimática a 22 ºC (V. parahaemolyticus, V. harveyi 1 e V. harveyi 2) também demonstraram que a influência das condições de cultura afeta diferencialmente as espécies e estirpes. A atividade esterásica foi estimulada pela diminuição da salinidade, diminuindo com a sucessiva redução do pH. O isolado V. alfacsensis, que não apresentou qualquer atividade enzimática a 22 e 37 ºC, adquiriu atividade esterásica com o decréscimo de 25% da salinidade. Apenas a atividade proteolítica do isolado V. parahaemolyticus foi afetada pelo pH, atingindo o seu maior índice a pH 8.2. A atividade lipolítica dos dois isolados de V. harveyi foi inibida com a diminuição da salinidade e aumento do pH. Para a sua deteção molecular, os primers desenvolvidos para as cinco espécies de Vibrio alvo são eficientes e específicos quando quantidades equivalentes dos diferentes DNAs genómicos são utilizados. Para testar a eficiência do PCR-multiplex (mPCR) desenvolvido na deteção de Vibrio spp. foram utilizadas amostras de mexilhão recolhidos da Ria Formosa segundo as indicações propostas na ISO 21872-1:2017 através de um duplo enriquecimento em meio de cultura apropriado para favorecer o crescimento das espécies de Vibrio. Uma amostra de cada enriquecimento incubada em TCBS indicou a presença de diversas colónias características das espécies de Vibrio, mas nenhuma correspondia à morfologia típica das espécies alvo deste estudo. Nas amostras por PCR usando individualmente os primers específicos para cada espécie foi detetado com base na análise molecular a presença de DNA de V. parahaemolyticus e V. harveyi, mas quando se aplicou o mPCR apenas se detetou V. harveyi. Isto sugere que poderá ter ocorrido alguma interferência na reação ou no microbioma do hospedeiro que inibiu a amplificação da deteção de V. parahaemolyticus ou então que a abundância de V. parahaemolyticus é muito inferior à de V. harveyi. Em resumo, sete novos isolados de Vibrio spp. (dos quais 4 representam duas estirpes das espécies V. harveyi e V. ichthyoenteri) foram identificados e caracterizados pela primeira vez. Caracterização microbiológica, molecular e bioquímica indica que os isolados de V. parahaemolyticus e V. harveyi podem representar potenciais agentes patogénicos humanos, pois são os únicos com capacidade de crescer a 37ºC. O aumento da temperatura favorece o seu crescimento e a atividade enzimática (proteolítica e hidrolítica) associada à sua virulência é alterada com a temperatura e modificação das condições ambientais. O impacto distinto das alterações nas condições de cultura entre os diferentes isolados indica que estes conseguem adaptar-se a diferentes condições, observando-se uma tendência para o aumento do crescimento e atividade enzimática com a diminuição da salinidade, mas o efeito oposto aquando da diminuição do pH. Mais ainda, as modificações nas condições de cultura podem estimular a atividade enzimática de enzimas associadas à virulência em isolados inicialmente não patogénicos, modificando desta forma a sua interação com o hospedeiro. No futuro, a sequenciação do genoma dos sete isolados será um passo fundamental para entender a sua biologia e outros testes mais detalhados deverão ser aplicados para verificar o efeito das alterações do meio de cultura na dinâmica destes isolados, tal como a realização de ensaios de infeção nos organismos vivos para ter uma perceção da sua dinâmica e relação com os hospedeiros nas condições mais próximas das ambientais.Power, DeborahCardoso, João CRSapientiaLeal, Inês Filipa Cabral2023-03-14T13:02:41Z2025-11-14T00:00:00Z2022-11-142022-11-14T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/19248TID:203247981enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-24T10:31:41Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/19248Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:08:53.255202Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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