Calcium signalling modulation in astrocytes by adenosine receptors

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Andreia Marisa Cruz e
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/8489
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011
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spelling Calcium signalling modulation in astrocytes by adenosine receptorsBioquímica MédicaTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011O modelo de sinapse actualmente aceite considera que para o processo de comunicação neuronal contribuem não só os neurónios pré- e pós-sináptico mas também um elemento peri-sináptico, os astrócitos. Estes constituem a população de células mais abundante no cérebro, formando juntamente com a micróglia e os oligodendrócitos a rede de células da glia. Presentemente, sabe-se que os astrócitos não são meros elementos passivos, comunicando activamente com as outras células através do seu mecanismo de excitabilidade que usa iões de cálcio (Ca2+) como mensageiro interno para desencadear a gliotransmissão. Este fenómeno é despoletado pela activação de receptores membranares e consiste na libertação de gliotransmissores (GT) como o glutamato, ATP e D-serina. A libertação de GT parece exercer uma função com características em certa medida semelhantes à libertação de neurotransmissores (NT) pelos neurónios. Esta conversa dinâmica e bidireccional entre neurónios e astrócitos depende da libertação de NT e GT que são reconhecidos por ambos os tipos de células. Desta forma, a libertação de NT do terminal pré-sináptico afecta o terminal pós-sináptico mas também os astrócitos envolventes, induzindo um aumento nos seus níveis intracelulares de Ca2+ [Ca2+]i. Em resposta, os astrócitos libertam GT, por um mecanismo não complemente elucidado, afectando novamente o terminal pós-sináptico e ainda a libertação de NT do terminal pré-sináptico. Através destes mecanismos, os astrócitos modulam a excitabilidade neuronal e a transmissão sináptica, havendo evidências de que também modulam fenómenos como a potenciação de longa duração que está intimamente ligada à memória e aprendizagem. As purinas, nomeadamente o ATP e a adenosina, modulam a gliotransmissão, regulando a transmissão sináptica e a comunicação neurónio-astrócito. O ATP desencadeia a sinalização por Ca2+, sendo um dos agentes dos primeiros eventos no processo de gliotransmissão em astrócitos. O aumento da [Ca2+]i mediado pelo ATP deve-se à activação de receptores metabotrópicos (P2YR), que levam à libertação de Ca2+ dos compartimentos intracelulares via fosfolipase C (PLC) e inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3), e de receptores ionotrópicos (P2XR), que medeiam a entrada directa de Ca2+ do exterior da célula. O ATP é convertido extracelularmente em adenosina e ambas as purinas se acumulam simultânea ou sequencialmente, estando os seus níveis aumentados em situações patológicas. Os receptores para o ATP (metabotrópicos P2YR e ionotrópicos P2XR) e para a adenosina (metabotrópicos A1R, A2AR, A2BR e A3R) são coexpressos nos astrócitos, o que sugere uma possível interacção entre estas duas famílias de receptores. Da família dos receptores de ATP, o P2Y1R exerce um papel preponderante no desencadear da gliotransmissão. Sabe-se que a adenosina modula a sinalização de Ca2+ desencadeada por neurotransmissores e neuromoduladores como o glutamato e ATP, no entanto, não se compreende completamente quais os receptores de adenosina envolvidos neste processo. É de salientar ainda que os receptores A1 estão negativamente acoplados ao AMP cíclico (cAMP) através de uma proteína Gi inibitória, diminuindo a libertação de GT. Os receptores A2A estão positivamente acoplados ao cAMP através de uma proteína Gs estimuladora, potenciando a libertação de GT. Estudos anteriores mostram que a adenosina modula diferencialmente a internalização de GABA em astrócitos corticais através dos seus receptores membranares de alta afinidade A1 e A2A. É de salientar que esta modulação depende da cooperação entre os receptores A1 e A2A. O principal objectivo deste trabalho é avaliar o papel dos receptores de adenosina, em particular do A2A, na modulação da sinalização por Ca2+. Pretende-se também explorar a possível cooperação entre os receptores A1 e A2A de adenosina no efeito modulatório. As respostas de Ca2+ em astrócitos corticais primários foram estudas pela técnica de imagiologia de Ca2+, usando um microscópio invertido de epifluorescência. O fluoróforo escolhido foi o Fura-2AM que é altamente sensível ao Ca2+, ligando este ião de forma estável e reversível. Trata-se de um fluorocromo raciométrico, uma vez, que sofre um desvio no comprimento de onda do pico de absorvência quando ligado ao Ca2+, de 380 (F380) para 340 (F340) nm. O rácio F340/F380 é usado para avaliar as variações da [Ca2+]i. A internalização do fluoróforo processa-se durante 45 minutos a 37oC e ocorre de forma passiva devido aos grupos AM que atribuem carga global negativa. Já dentro da célula, os grupos AM são clivados por enzimas e o fluoróforo fica retido no interior da célula. As células foram local e brevemente (0,2 segundos) estimuladas com 10 μM ATP, a 22 oC, e a amplitude das respostas foi medida na presença de diferentes fármacos. Foi usado um análogo estável da adenosina, 2-cloroadenosina (CADO), um agonista e um antagonista selectivos para o receptor A2A, CGS 21680 e SCH 58261, respectivamente, e um antagonista selectivo para o receptor A1, DPCPX. No protocolo desenvolvido e optimizado no decurso do projecto, as células foram estimuladas de 5 em 5 minutos e obteve-se respostas para a situação controlo, apenas com tampão HEPES no meio, de seguida na presença do fármaco, que é mantido no meio de perfusão no mínimo durante 15-20 minutos, seguindo-se finalmente a lavagem com tampão HEPES ou com uma mistura de agonista/antagonista do receptor. Como controlo interno, foi ainda obtida a resposta máxima da célula a um estímulo supramáximo, 100 μM ATP. O desenvolvimento deste protocolo dependeu da optimização de uma serie de parâmetros como o período de intervalo entre estimulações, a concentração de ATP usada como estimulo, a duração de cada estimulação, a temperatura da incubação com o fluoróforo e a temperatura de perfusão usada durante toda o registo de sinais de Ca2+. As culturas primárias foram caracterizadas quanto às populações de células presentes, astrócitos, neurónios e micróglia, pela técnica de imunocitoquímica, recorrendo a anticorpos que marcam especificamente estas células. Detectou-se ainda a presença dos receptores de ATP, P2Y1, e de adenosina, A1 e A2A, pela técnica de western blot, aplicando anticorpos específicos para estas proteínas. Observei que a estimulação breve com 10 μM ATP (0,2 segundos) induz um transiente de Ca2+ rápido. A estimulação prolongada (≥ 20 segundos) com ATP induz uma resposta de Ca2+ bifásica, constituída por um pico inicial, seguindo-se um patamar na resposta. Segundo outros autores, o pico inicial é mediado por receptores P2Y e o patamar por receptores P2X. O envolvimento dos receptores P2Y no pico inicial foi comprovado na presença de baixa concentração de Ca2+ extracelular. O análogo estável da adenosina que apresenta afinidade semelhante para os receptores A1 e A2A, 1 μM CADO, potenciou marcadamente a resposta de Ca2+ desencadeada pelo ATP (aumento da resposta: 3,19 ± 0,30 vezes, n=72 células). O agonista selectivo para o receptor A2A, 30nM CGS 21680, imitou este efeito (2,92 ± 0,32 vezes, n=80 células). Estes efeitos foram completamente revertidos após remoção do agonista do meio de perfusão. O parâmetro ‘aumento da resposta’ é o rácio entre a amplitude da resposta ao ATP na presença do fármaco e a amplitude da resposta na ausência de fármaco. Foi ainda calculado o parâmetro ‘resposta controlo/resposta máxima’, tendo observado uma relação inversa entre os valores de aumento de resposta e resposta controlo/resposta máxima. Desta forma, as células que apresentam uma menor resposta controlo em relação à resposta máxima, determinada na presença de 100 μM ATP, sofrem um aumento mais elevado induzido pelos agonistas, CADO e CGS 21680. Tal variabilidade de respostas mostra que estamos perante uma população de células heterogéneas. Para estudar a possível cooperação e/ou interacção entre os receptores A1 e A2A, foram usados antagonistas específicos para estes receptores de forma a testar se revertiam a potenciação induzida pelos agonistas. Verifiquei que os antagonistas, 50 nM SCH 58261 e 50 nM DPCPX, por si só, não induziam variação apreciável na resposta de Ca2+. Surpreendentemente, a potenciação induzida pelo CADO (agonista não-selectivo A1 e A2A) e pelo CGS 21680 (agonista selectivo A2A) foi completamente revertida não só pelo antagonista específico do receptor A2A, SCH 58261, mas também pelo antagonista específico do receptor A1, DPCPX. Tais resultados mostram que a activação de ambos os receptores, A1 e A2A, é fundamental para que o efeito modulatório se verifique, sugerindo a cooperação entre estes receptores. A caracterização das culturas primárias pela técnica de imunocitoquímica mostrou que estas são constituídas maioritariamente por astrócitos (> 90%) e alguma micróglia. Desta forma, pode-se afirmar que estamos perante culturas primárias enriquecidas em astrócitos. A introdução de um passo extra de agitação ao dia 6 de cultura, antes de replaquear as células, permite obter culturas com uma maior percentagem de astrócitos (> 95%) em relação à micróglia. Recorrendo à técnica de western blot foi possível detectar a presença dos receptores de ATP, P2Y1, e de adenosina, A1 na cultura enriquecida em astrócitos. No entanto, usando esta técnica, não foi possível detectar os receptores A2A de adenosina. Uma vez, que a presença de receptores A2A já foi observada anteriormente em astrócitos corticais e que pela técnica de imagiologia de Ca2+, aqui aplicada, foram obtidas respostas a fármacos específicos para estes receptores, pode-se afirmar que estes receptores estão presentes nas culturas primárias usadas neste estudo. Provavelmente a sua densidade será baixa e desta forma difícil de quantificar por western blot. Os resultados aqui apresentados permitem concluir que a adenosina, através da activação de receptores A2A, facilita a sinalização por Ca2+ induzida pelo ATP, em astrócitos corticais. Mais ainda, a cooperação entre os receptores A1 e A2A, parece ser essencial para a modulação observada. O envolvimento de receptores A2A na modulação da sinalização de Ca2+ aqui demonstrado contrapõe resultados anteriores nos quais outros autores mostraram que estes receptores não tinham qualquer efeito sobre a modulação das respostas de Ca2+. Esses autores mostraram ainda que os receptores A2B de adenosina medeiam a modulação da sinalização por Ca2+. No entanto, no trabalho anterior foram usadas concentrações de fármacos não selectivas para os receptores correspondentes, o que poderá justificar as diferenças nos resultados obtidos. Os resultados aqui apresentados estão de acordo com o modelo tetramérico - A1-A1-A2A-A2A - de receptores de adenosina proposto para a modulação diferencial da internalização de GABA pela adenosina, em astrócitos corticais. Os resultados aqui obtidos apoiam um cenário semelhante para a modulação da sinalização de Ca2+ pela adenosina com possíveis implicações na libertação de GT. Trata-se por isso de um novo mecanismo de modulação sináptica indirecto que é provavelmente mediado pela cooperação dos receptores A1 e A2A de adenosina, permitindo uma regulação apertada e uma transição suave entre os estados inibitório e potenciador.Purines, namely ATP and adenosine, modulate gliotransmission, regulating synaptic transmission and ultimately neuron-astrocyte communication. ATP triggers the signalling of free calcium ions (Ca2+), which is the substrate for gliotransmission, in astrocytes. ATP is extracellularly converted into adenosine and both purines can be accumulated simultaneously or sequentially, acting on a plethora of membrane astrocytic receptors. Adenosine modulates GABA uptake in cortical astrocytes through A1 (A1R) and A2A (A2AR) receptors. Most importantly, this modulation is dependent on tight A1R-A2AR cooperation. Therefore, the aim of this project was to evaluate the role of adenosine receptors, mainly A2AR, in Ca2+ signalling modulation and also to explore the possible cross-talk between A1R and A2AR in this modulation. Ca2+ responses of cortical primary astrocytes were studied by Ca2+ imaging technique using Fura-2AM, at 22oC. Cells were locally and briefly (0.2 seconds) stimulated with 10μM ATP and the amplitude of fluorescence signals was measured in the presence of different drugs. Cultures were further characterized by immunocytochemistry and western blot techniques. A stable adenosine analogue, 2-Chloroadenosine (1 μM), markedly enhanced ATP-induced Ca2+ responses (fold increase: 3.19 ± 0.30, n=72 cells). An A2AR selective agonist, CGS 21680 (30nM), mimicked this effect (2.92 ± 0.32, n=80 cells). The potentiation mediated by both agonists was not only completely reverted by an A2AR selective antagonist, SCH 58261 (50nM), but also by an A1R selective antagonist, DPCPX (50nM). Primary enriched astrocytic cultures are constituted mainly by astrocytes (> 90%) and microglial cells. The presence of ATP, P2Y1R, and adenosine, A1R, but not A2AR could be demonstrated for primary astrocytic cultures. Nevertheless, selective agonists and antagonist used in Ca2+ imaging have proven the presence of functional A2AR. It is concluded that adenosine, through A2AR activation, potentiates ATP-induced Ca2+ signalling in astrocytes. Furthermore, A1R-A2AR cooperation seems to be required for this modulation.Sebastião, Ana Maria, 1958-Lima, Pedro A.Repositório da Universidade de LisboaSilva, Andreia Marisa Cruz e2013-05-21T15:11:48Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/8489enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:52:24Zoai:repositorio.ul.pt:10451/8489Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:01.439040Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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