Expressão e purificação da proteína NS3 do vírus dengue tipo 3

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Rayane Nogueira dos
Data de Publicação: 2012
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UCB
Texto Completo: https://repositorio.ucb.br:9443/jspui/handle/10869/1631
Resumo: Biomedicina
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Em específico, a proteína não estrutural NS3 é uma proteína multifuncional com 619 aminoácidos que funciona como serino-protease e RNA helicase. O objetivo desse estudo foi expressar e purificar a proteína NS3 do DENV tipo 3 para que torne possível obter conhecimentos estruturais e posteriormente desenvolver inibidores da protease. A partir de uma amostra de soro positivo para DENV 3 foi feita extração, transcrição reversa e PCR do gene da proteína NS3. Em seguida, fragmentos de DNA do gene de NS3 foram clonados em vetor plasmidial pGEM-T. Após a confirmação do gene por sequenciamento foi feita subclonagem utilizando o vetor pET28a em células E. coli DH5α. Após esse processo foi feita uma nova transformação utilizando o vetor pET28a em células E. coli BL21 (DE3) para a expressão da proteína, confirmado com PAGE por Comassie blue e Western blotting. A expressão da proteína NS3 do DENV3 foi obtida com sucesso apresentando características insolúveis.Dengue is a disease transmitted to humans by Aedes aegypti mosquitoes infected with Dengue virus (DENV), which is responsible for large epidemics of dengue. These viruses belong to the family Flaviviridae, genus Flavivirus. The genome consists of a positive strand RNA with approximately 11 kb and has four distinct serotypes (DENV-1, 2, 3 and 4). Viral genome encodes three structure proteins (C, prM and E) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A / B, NS3, NS4A / B and NS5). In particular, the non-structural protein NS3 is a multifunctional protein with 619 amino acids which functions as serine protease and RNA helicase. The objective of this study was to express and purify the DENV-3 NS3 protein to make it possible to obtain knowledge about structural and subsequently develop protease inhibitors. In order to accomplish this, a positive serum sample against DENV-3 was used for RNA extraction, reverse transcription and PCR of the NS3 protein gene. Then, DNA fragments of NS3 gene were cloned into plasmid vector pGEM-T. After confirmation by sequencing, NS3 gene was subcloning into the vector pET28a and E. coli DH5α cells were transformed. After this process a new transformation was done using the vector pET28a in E. coli BL21 (DE3) for protein expression. The production of the protein was confirmed with PAGE followed by Comassie blue staining and Western blotting. 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