Expressão da proteína recombinante cistatina do ovo de galinha em E. coli

• Autor(a) principal: Nascimento, Cristina Pimentel do
• Data de Publicação: 2009
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UCB
• Texto Completo: https://repositorio.ucb.br:9443/jspui/handle/123456789/12118
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS; Cistatinas; Proteínas; E. coli

As cistatinas são proteínas inibidoras de proteinases cisteínicas, sendo que a primeira cistatina descrita foi isolada da clara do ovo de galinha (Gallus gallus domesticus) e teve sua atividade caracterizada pela inibição da enzima papaína, um tipo de proteinase cisteínica. Alguns fitopatógenos possuem proteinases cisteínicas intestinais que atuam na sua dieta. Dessa forma, os inibidores de proteinases são importantes ferramentas utilizadas pela natureza para o controle de pragas. A descoberta e o conhecimento das proteínas que funcionam como inseticidas é um ponto de grande relevância para obtenção de plantas resistentes a pragas. O potencial destas proteínas de interferir com a digestão de proteínas em fungos e insetos foi utilizado como base teórica para experimentos de super-expressão destas proteínas em plantas com o objetivo de conferir resistência contra patógenos cuja digestão de proteínas dependesse de proteinases cisteínicas. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi expressar a proteína cistatina do ovo de galinha em E. coli a fim de obter grande quantidade da proteína para ser utilizada em trabalhos posteriores como bioensaios testando seu potencial de inibição em sementes sintéticas de plantas suscetíveis a insetos praga. Para isso, inicialmente foi construído um vetor de expressão específico para bactérias utilizando o plasmídeo pET19a e o gene da cistatina do ovo de galinha e usado para transformar a cepa BL21DE3 de E. coli. A cultura de bactérias crescida em meio LB líquido com o antibiótico específico até atingir O.D.600 0.6 então a expressão foi induzida com a adição de IPTG a 0,8 uM mantido em agitão a 37º C por 3 horas e coletadas alíquotas da cultura a cada uma hora com o objetivo de determinar o melhor tempo de expressão para esta proteína. As alíquotas foram centrifugadas e o extrato bruto (5uL) foi apliado diretamente em em gel de poliacrilamida SDS-page e em seguinda este foi utilizado para western blot utilizando anticorpos contra his-tag. Todo este procedimento foi realizado também em bactérias transformadas com o vetor pET19b sem conter o gene servindo como controle negativo. O western blot confirmou a presença da cistatina e o melhor tempo de expressão observado foi o de 2h após a adição de IPTG. A partir daí, serão realizadas expressões em maior quantidade de meio de cultura e purificações em coluna anti-his-tag a fim de obter alta quantidade da proteína em questão, etapa esta necessária para os trabalhos posteriores. No presente estudo foi verificado como dito anteriormente que a cistatina pode ser expressa de forma heteróloga em E coli.