Caracterização in silico e in vivo do promotor do gene galactinol sintase de Coffea spp

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Girotto, Larissa
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UEL
Texto Completo: https://repositorio.uel.br/handle/123456789/9279
Resumo: Resumo: O café, é uma das mais importantes commodities agrícolas, sendo o Brasil seu maior produtor e exportador As mudanças climáticas globais têm causados danos a produtividade agrícola cafeeira com impactos econômicos e sociais, incluindo a redução de áreas disponíveis para o plantio de café Uma das alternativas biotecnológicas para resolver esse problema é produção de cafeeiros geneticamente modificados e tolerantes a estresses abióticos Diante desse cenário foi investigado o potencial do promotor da galactinol sintase (GolS) do gênero Coffea, que catalisa a primeira etapa da via de síntese dos oligossacarídeos da família da Rafinose, cujo acúmulo ocorre em resposta a estresses abióticos Entender a arquitetura dos promotores de café, tornou-se fundamental para modular a regulação da expressão gênica em períodos de estresse abióticos 1 promotores de GolS foram encontrados nos genomas públicos disponíveis de Coffea spp Estes apresentaram 12 diferentes tipos de cis-elementos que regulam a resposta gênica e são induzidos por estresses ambientais Os que mais se destacaram foram ARE (indução anaeróbica), ABRE e MYB (resposta do Ácido abscísico - ABA) e STRE (presente nos promotores de genes que são regulados durante o estresse) Após a caracterização dos promotores, um promotor GolS, isoforma de Coffea canephora (Cc), foi selecionado e clonado com o objetivo de verificar a sua expressão em experimentos de estresse abiótico induzido O promotor CcGolS3 fusionado ao gene repórter da ß-glucuronidase (GUS) foi utilizado para transformar Arabidopsis thaliana Para analisar a atividade deste promotor, as plantas transformadas foram submetidas a estresses hídrico, salino e de temperatura A atividade do gene GUS foi analisada histoquimicamente e por RTqPCR A coloração histoquímica do gene repórter GUS foi verificada em todos os tecidos de A thaliana que possuiam a construção pCcGolS3::GUS, provavelmente devido a uma atividade leaky do promotor As análises de RT-qPCR do promotor de CcGolS3 evidenciou o aumento no número de transcritos de GUS em plantas sob estresse hídrico, salino e de frio, mesmo com a presença do leaky, comportando-se como um promotor do tipo estresse-induzido e demonstrando o potencial uso do mesmo em projetos futuros de transformação de plantas
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ABA) e STRE (presente nos promotores de genes que são regulados durante o estresse) Após a caracterização dos promotores, um promotor GolS, isoforma de Coffea canephora (Cc), foi selecionado e clonado com o objetivo de verificar a sua expressão em experimentos de estresse abiótico induzido O promotor CcGolS3 fusionado ao gene repórter da ß-glucuronidase (GUS) foi utilizado para transformar Arabidopsis thaliana Para analisar a atividade deste promotor, as plantas transformadas foram submetidas a estresses hídrico, salino e de temperatura A atividade do gene GUS foi analisada histoquimicamente e por RTqPCR A coloração histoquímica do gene repórter GUS foi verificada em todos os tecidos de A thaliana que possuiam a construção pCcGolS3::GUS, provavelmente devido a uma atividade leaky do promotor As análises de RT-qPCR do promotor de CcGolS3 evidenciou o aumento no número de transcritos de GUS em plantas sob estresse hídrico, salino e de frio, mesmo com a presença do leaky, comportando-se como um promotor do tipo estresse-induzido e demonstrando o potencial uso do mesmo em projetos futuros de transformação de plantasTese (Doutorado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularAbstract: Coffee is one of the most important agricultural commodities, and Brazil is its largest producer and exporter Global climate change has damaged coffee agricultural productivity with economic and social impacts, including the reduction of areas available for coffee planting One of the biotechnological alternatives to reduce this problem is genetically modified coffee to be tolerant to abiotic stress In this scenario, the potential of the galactinol synthase (GolS) promoter of Coffea spp, which catalyzes the first step of rafinosis family oligosaccharides biosynthesis, whose accumulation occurs mainly in response to abiotic stresses Understanding the structure and composition of coffee promoter gene sequences is of fundamental to better understand the genetic mechanisms and processes of gene expression regulation induced in periods of drought and salt stress We analysed 1 GolS promoters present in the public genomes of Coffea arabica, C canephora and C eugenioides Those promoters presented, 12 cis-elements related to gene regulation in response to adverse conditions, including ARE (anaerobic induction), ABRE and MYB (abscisic acid response - ABA) and STRE (present in promoters that are regulated during stress) Subsequently in silico characterization of C canephora CcGolS3 was perfomed and this promoter was cloned in order to verify its role against abiotic stresses Plasmids containing the pCcGolS3::GUS construction (ß-glucuronidase reporter gene) were used to transform Arabidopsis thaliana to analyze GolS promoter activity under stress Transformed plants were subjected to water deficit, salt and temperature stresses experiment Activity of GUS reporter gene was analyzed histochemically and by RTqPCR Histochemical staining of GUS reporter gene was verified in all A thaliana tissues in plants containing pCcGolS3::GUS construct, probably due to a leaky activity RT-qPCR analyzes of CcGolS3 promoter showed an increase in the number of GUS transcripts in plants under drought, saline and cold stress, even with the leaky effect, demonstrating its potential use as stress-induced promoter for future plant genetic engineering transformation projectsPereira, Luiz Filipe Protasio [Orientador]Molinari, Hugo Bruno CorreaVilas-Bôas, Laurival AntônioCação, Sandra Maria BellodiIvamoto-Suzuki, Suzana TiemiSantos, Tiago Benedito dos [Coorientador]Girotto, Larissa2024-05-01T11:54:31Z2024-05-01T11:54:31Z2020.0031.01.2020info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/9279porDoutoradoGenética e Biologia MolecularCentro de Ciências BiológicasPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularLondrinareponame:Repositório Institucional da UELinstname:Universidade Estadual de Londrina (UEL)instacron:UELinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-07-12T04:19:53Zoai:repositorio.uel.br:123456789/9279Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.bibliotecadigital.uel.br/PUBhttp://www.bibliotecadigital.uel.br/OAI/oai2.phpbcuel@uel.br||opendoar:2024-07-12T04:19:53Repositório Institucional da UEL - 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