Diferenciação entre Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans utilizando a região do espaço intergênico 1 (IGS1) do DNA ribossomal por PCR em tempo real

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Tavares, Eliandro Reis
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEL
Texto Completo: https://repositorio.uel.br/handle/123456789/13500
Resumo: Resumo: A incidência de infecções fúngicas oportunistas tem aumentado principalmente entre pacientes portadores de HIV A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, sendo C neoformans e C gattii as espécies clinicamente mais importantes Estas acometem principalmente pacientes imunossuprimidos, entretanto C gattii pode causar doença também em indivíduos imunocompetentes Neste trabalho foi padronizada uma reação de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para a identificação de C neoformans e C gattii tendo como alvo a região IGS1 (intergenic spacer 1) do rDNA Sequências correspondentes à região IGS1 de C gatti e C neoformans foram buscadas no GenBank e, após a análise, foi deduzida as sequências consensos, utilizadas para a síntese dos oligonucleotídeos iniciadores CnIGS1-F e CnIGS1-R, e CgIGS1-F e CgIGS1-R específicos para C neoformans e C gattii, respectivamente As cepas C neoformans ATCC 6631 e C gattii ATCC 5699 foram utilizadas como referência para os ensaios Inicialmente, o DNA genômico foi obtido de céluas em fase de crescimento exponencial, e quantificado por espectrometria a 26/28 nm A reação foi realizada usando 1 ng de DNA como molde, Platinum Quantitative SuperMix-UDG kit, oligonucleotídeos iniciadores; as amostras foram corridas em um termociclador Rotor Gene 6 As curvas de dissociação (melting curve) foram geradas em ambas as corridas, entre 6° C e 95° C, com um aumento de ,5 °/segundo, para observação dos picos de dissociação Os resultados mostraram dois diferentes picos de dissociação: 82,8 °C e 84,2 °C para C gattii e C neoformans, respectivamente Não foi observada amplificação quando DNA total, de C albicans, C tropicalis, C dubliniensis, H capsulatum, T rubrum, S schenckii, P brasiliensis ou H sapiens foi utilizada na PCR Em conclusão, a amplificação por PCR em tempo real foi específica, permitindo a identificação de ambos os fungos, mostrando que a região IGS1 apresenta polimorfismo, podendo ser usada como um marcador molecular Assim, os oligonucleotídeos iniciadores desenhados podem ser utilizados na identificação de C neoformans e C gattii
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the clinical symptoms range from asymptomatic pulmonary colonization to disseminated disease and meningitis Cryptococcosis is caused by yeast of the genus Cryptococcus, whereas C neoformans and C gattii are the clinically most important species These affect mainly immunocompromised patients; however C gattii can also cause disease in immunocompetent individuals In this work it was standardized an amplification by real time polymerase chain reaction (PCR) to identify C neoformans and C gattii, targeting the IGS1 (intergenic spacer 1) region of the rDNA Sequences corresponding to IGS1 region of C gattii and C neoformans were retrieved from GenBank, and, after sequence analyses, it was deducted the consensus sequences used for the synthesis of CnIGS1-F/R and CgIGS1-F/R primers, specific for C neoformans and C gattii, respectively The strains C neoformans ATCC 6631 and C gattii ATCC 5699 were used as reference for the assays Innitially, the genomic DNAs were obtained from cells in exponential growth phase, and quantify by spectrometry at 26/28nm The reactions were performed using 1 ng of DNA as template, Platinum Quantitative SuperMix-UDG kit, primers, and the samples were running in the Rotor Gene 6 thermocycler The melting curves were generated from both runs from 6 to 95 ºC at 5 ºC/sec to show the melting peaks The results showed the two distinctive melting temperatures: 828 °C e 842 °C for C gattii e C neoformans, respectively No amplification were observed when total DNA of C albicans, C tropicalis, C dubliniensis, H capsulatum, T rubrum, S schenckii, P brasiliensis or H sapiens was used in PCR As conclusion, the real time PCR amplification was specific, allowing the identification of both fungus, showing that the IGS 1 sequence presents polymorphism and it can be used as molecular target Overall, the designed primers can be used in the identification of C neoformans and C gattiiLioni, Lucy Megumi Yamauchi [Orientador]Barros, Tânia Fraga deVenâncio, Emerson JoséTavares, Eliandro Reis2024-05-01T14:15:38Z2024-05-01T14:15:38Z2012.0009.03.2012info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/13500porMestradoMicrobiologiaCentro de Ciências BiológicasPrograma de Pós-Graduação em MicrobiologiaLondrinareponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UELinstname:Universidade Estadual de Londrina (UEL)instacron:UELinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-07-04T02:07:20Zoai:repositorio.uel.br:123456789/13500Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.bibliotecadigital.uel.br/PUBhttp://www.bibliotecadigital.uel.br/OAI/oai2.phpbcuel@uel.br||opendoar:2024-07-04T02:07:20Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEL - Universidade Estadual de Londrina (UEL)false
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description Resumo: A incidência de infecções fúngicas oportunistas tem aumentado principalmente entre pacientes portadores de HIV A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, sendo C neoformans e C gattii as espécies clinicamente mais importantes Estas acometem principalmente pacientes imunossuprimidos, entretanto C gattii pode causar doença também em indivíduos imunocompetentes Neste trabalho foi padronizada uma reação de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para a identificação de C neoformans e C gattii tendo como alvo a região IGS1 (intergenic spacer 1) do rDNA Sequências correspondentes à região IGS1 de C gatti e C neoformans foram buscadas no GenBank e, após a análise, foi deduzida as sequências consensos, utilizadas para a síntese dos oligonucleotídeos iniciadores CnIGS1-F e CnIGS1-R, e CgIGS1-F e CgIGS1-R específicos para C neoformans e C gattii, respectivamente As cepas C neoformans ATCC 6631 e C gattii ATCC 5699 foram utilizadas como referência para os ensaios Inicialmente, o DNA genômico foi obtido de céluas em fase de crescimento exponencial, e quantificado por espectrometria a 26/28 nm A reação foi realizada usando 1 ng de DNA como molde, Platinum Quantitative SuperMix-UDG kit, oligonucleotídeos iniciadores; as amostras foram corridas em um termociclador Rotor Gene 6 As curvas de dissociação (melting curve) foram geradas em ambas as corridas, entre 6° C e 95° C, com um aumento de ,5 °/segundo, para observação dos picos de dissociação Os resultados mostraram dois diferentes picos de dissociação: 82,8 °C e 84,2 °C para C gattii e C neoformans, respectivamente Não foi observada amplificação quando DNA total, de C albicans, C tropicalis, C dubliniensis, H capsulatum, T rubrum, S schenckii, P brasiliensis ou H sapiens foi utilizada na PCR Em conclusão, a amplificação por PCR em tempo real foi específica, permitindo a identificação de ambos os fungos, mostrando que a região IGS1 apresenta polimorfismo, podendo ser usada como um marcador molecular Assim, os oligonucleotídeos iniciadores desenhados podem ser utilizados na identificação de C neoformans e C gattii
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