Produção, caracterização e avaliação da imunogenicidade do complexo protéico MSP1 recombinante (rMSP1a erMSP1b) de isolado paranaense do anaplasma marginale

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Tamekuni, Katia
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UEL
Texto Completo: https://repositorio.uel.br/handle/123456789/10414
Resumo: Resumo: O Anaplasma marginale (ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina Esta doença ocorre mundialmente, com maior freqüência nas regiões tropicais e subtropicais, determinando perdas econômicas consideráveis à pecuária bovina O A marginale possui seis proteínas principais de superfície designadas de MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 A proteína MSP1a tem massa molecular de 15kDa e a MSP1b de 1kDa Os objetivos deste trabalho foram clonar, produzir, caracterizar as MSP1a e MSP1b recombinantes (rMSP1a e rMSP1b) e avaliar a resposta imune humoral de camundongos imunizados com a Escherichia coli BL21 recombinante expressando estas proteínas Os genes msp1a e msp1b foram obtidos pela PCR de um isolado Paranaense de A marginale e clonados em vetores pET12 e pET11/D-TOPO, respectivamente Após a certificação da inserção dos genes nos vetores, as proteínas foram induzidas com IPTG e purificadas em colunas de resina ligadas ao níquel As proteínas rMSP1a e rMSP1b separadas em SDS-PAGE, reagiram com soros anti-rMSP1a e anti-rMSP1b produzidos em coelhos, pelo Western blotting, mostrando massas moleculares de 7kDa a 15kDa e 1kDa, respectivamente A BL21/rMSP1a e a BL21/rMSP1b aglutinaram as hemácias de bovinos e esta hemaglutinação foi inibida na presença de IgY anti-rMSP1a e anti-rMSP1b, confirmando a função de adesão destas proteínas A reação de IFI realizada com as IgY anti-rMSP1a e IgY anti-rMSP1b, produzidas em galinhas, demonstraram a presença destas proteínas na membrana externa das E coli BL21 recombinantes As BL21/rMSP1a e BL21/rMSP1b também foram utilizadas para imunizar camundongos Balb/c para avaliação de produção de IgG total e IgG2a, por meio de técnica de ELISA Os animais imunizados com BL21/rMSP1a tiveram uma forte resposta humoral (IgG total e IgG2a), enquanto que os camundongos imunizados com a BL21/rMSP1b apresentaram uma fraca resposta após as três primeiras imunizações Pelo Western blotting foi detectado, resposta de IgG total contra as proteínas rMSP1a e rMSP1b Soros de camundongos imunizados com BL21/rMSP1a reagiram com a BL21 e rMSP1a com massas moleculares variando de 7 a 15 kDa e uma banda de 2 kDa sugerindo a quebra da proteína Soros de animais imunizados com a BL21/rMSP1b reagiram com a BL21 e rMSP1b com massa molecular de 1 kDa Os resultados deste trabalho confirmam o papel das MSP1a e MSP1b como adesinas no processo de invasão de eritrócitos e evidenciam a importância destas proteínas na elaboração de uma vacina de subunidades para o controle da anaplasmose bovina Também demonstram que as BL21 expressando as rMSP1a e a rMSP1b na membrana externa são capazes de produzir resposta imune em camundongos
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Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência AnimalAbstract: The Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) is a pathogen that cause bovine anaplasmosis This disease occurs in world wide, and it is more frequently in tropical and subtropical areas, causing important economic losses in cattle herds Six Major Surface Protein (MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 and MSP5) have been identified in A marginale The function of MSP1a and MSP1b is adhesion in bovine erythrocytes and tick cells The molecular mass of these proteins is 15kDa for MSP1a and 1kDa for MSP1b The objectives of this work were clone, produce and characterizate recombinant proteins from MSP1a and MSP1 and to evaluate the humoral immune responses in mice immunized with Escherichia coli BL21 recombinant expressing rMSP1a and rMSP1 of A marginale The msp1a and msp1b gene obtained from a PCR assay of A marginale from Parana isolated, were cloned into vectors pET12 and pET11/D-TOPO, respectively After certification of the recombinant vector construction, these vectors were transformed into E coli BL21 Star and the proteins were expressed on E coli BL21Star after induction by IPTG and purified in resin charged with the nickel ion Antibodies anti-MSP1a and anti-MSP1b reacted with rMSP1a and MSP1b showing a molecular mass of 7 kDa to 15 kDa and 1 kDa, respectively rMSP1a and rMSP1b were inoculated in chickens to produce IgY anti-MSPs Bovine erythrocytes were agglutinated with BL21/rMSP1a and BL21/rMSP1b and, this agglutination was inhabited by the presence of the IgY anti rMSP1a and rMSP1b, confirming the adhesion function of these proteins Indirect immunofluorescence assay (IFA) was performed using IgY anti-rMSP1a and rMSP1b, and we observed reaction in the external membrane of the recombinant E coli BL21 Additionally, Balb/c were immunized with BL21/rMSP1a and rMSP1b, and the production of whole IgG and IgG2a were determined by indirect ELISA The animals immunized with BL21/rMSP1a had a strong humoral response (whole IgG and IgG2a), while the mice immunized with BL21/rMSP1b presented a weak response after three immunizations Western blotting of whole IgG was detected against the proteins rMSP1a and rMSP1b Sera of mice immunized with BL21/rMSP1a reacted with BL21 and rMSP1a with molecular masses varying from 7 to 15 kDa and a band of 2 kDa suggesting the break of the protein Sera from mice immunized with BL21/rMSP1b reacted with BL21 and rMSP1b in a molecular mass of 1 kDa In conclusion, the results confirmed the adhesion function of rMSP1a and rMSP1b in the bovine erythrocytes invasion mechanism and showed the importance of these recombinant proteins in the development of a new vaccine for the bovine anaplasmosis control In addition these results also demonstrated that BL21 containing the rMSP1a and arMSP1b in the outer membrane are able to produce immune response in mice, and could be supposed that will also be able to induce protection against the bovine anaplasmosisVidotto, Odilon [Orientador]Garcia, João LuisAlfieri, Amauri AlcindoVidotto, Marilda Carlos [Coorientadora]Tamekuni, Katia2024-05-01T12:42:37Z2024-05-01T12:42:37Z2006.0016.02.2006info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/10414porMestradoCiência AnimalCentro de Ciências AgráriasPrograma de Pós-graduação em Ciência AnimalLondrinareponame:Repositório Institucional da UELinstname:Universidade Estadual de Londrina (UEL)instacron:UELinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-07-12T04:20:12Zoai:repositorio.uel.br:123456789/10414Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.bibliotecadigital.uel.br/PUBhttp://www.bibliotecadigital.uel.br/OAI/oai2.phpbcuel@uel.br||opendoar:2024-07-12T04:20:12Repositório Institucional da UEL - 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