PCR em tempo real para detecção e quantificação de Aspergillus Westerdijkiae em grãos de café

• Autor(a) principal: Morello, Luis Gustavo
• Data de Publicação: 2024
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UEL
• Texto Completo: https://repositorio.uel.br/handle/123456789/10057
• topic: Alimentos; Microbiologia; Aspergillus; Reação em cadeia de polimerase; Micotoxinas; Polymerase chain reaction; Food - Microbiology; Micotoxicoses

Resumo: Ocratoxina A (OA) é uma micotoxina encontrada tanto em grãos de café como na bebida preparada a partir de grãos contaminados O perfil toxicológico desta micotoxina inclui carcinogenicidade, nefrotoxicidade e imunotoxicidade O café é uma bebida extensivamente consumida no mundo e o Brasil se configura como o maior produtor de grãos de café do mundo Apesar do café não ser a principal fonte de OA no consumo humano, ações para evitar a presença deste metabólito em grãos de café são necessárias para diminuir a exposição humana a esta micotoxina OA foi descoberta em 1965, como um metabólito secundário de A ochraceus, mas após isso, várias outras espécies de Aspergillus e Penicillium foram descritas como produtoras de OA Atualmente, Aspergillus westerdijkiae é reconhecido como a mais importante espécie produtora de OA em grãos de café Aspergillus westerdijkiae é uma nova espécie de fungo que foi recentemente desmembrada a partir do taxon Aspergillus ochraceus Essa espécie é muito similar a A ochraceus e vários isolados previamente identificados como A ochraceus, agora são identificados como A westerdijkiae De acordo com a literatura, isolados de A westerdijkiae são muito freqüentes e a maioria deles é capaz de produzir grandes quantidades de OA Neste trabalho, vários isolados obtidos de amostras de grãos de café brasileiro, previamente identificados como A ochraceus foram comparados com aquelas de A westerdijkiae através das seqüências de nucleotídeos que codifica para a ß-tubulina De fato, a maioria (84%) foi reconhecida como pertencente à espécie A westerdijkiae Devido ao fato que isolados de A westerdijkiae freqüentemente produzem grandes quantidade de OA, desenvolveu-se um par de primers específico para detectar e quantificar esta espécie em grãos de café utilizando-se da técnica de PCR em tempo real O par de primers desenhado (Bt2Aw-F 5'TGATACCTTGGCGCTTGTGACG / Bt2Aw-R 5'CGGAAGCCTAAAAAATGAAGAG) permitiu a obtenção de um amplicon de 347 pb em todos os isolados de A westerdijkiae e nenhuma reação cruzada foi observada usando DNA de A ochraceus A especificidade deste par de primers para amplificar A westerdijkiae motivou a investigação da possibilidade de seu uso para quantificar A westerdijkiae em grãos de café Após inoculação e incubação de grãos de café, extrações de DNA e ensaios de cfu foram realizadas em intervalos de 48 h Embora uma x correspondência entre o número de genomas haplóides e cfu tenha sido observada, a estimativa dos números de cópia de genoma foi sempre maior do que os números de cfu Utilizando diluições seriadas (1-1 a 1-9) do DNA extraído de grãos de café infectados, e incubados por 48 h, detectou-se um sinal positivo até a diluição de 1-5, o que significa mais de 1 e menos de 1 cópias de genoma haplóide de A westerdijkiae Este valor também significa menos de 1 genomas haplóides por ,1 grama de grãos de café O nível de sensibilidade do PCR em tempo real foi 1 vezes maior do que a técnica de cfu Palavras-chaves: Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus ochraceus, ocratoxina A, PCR em tempo real