Otimização do método de geração de plantas compostas de soja e validação de normalizadores para estudos de expressão genica por RT-QPCR em resposta a infecção por Meloidogynes javanica

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Kuma, Kátia Miki
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UEL
Texto Completo: https://repositorio.uel.br/handle/123456789/15155
Resumo: Resumo: Os métodos aplicados à analise funcional de genes são de fundamental importância na validação de resultados obtidos de estudos in silico e/ou de prospecção gênica Os métodos de transformação genética para a obtenção de tecidos com expressão transiente e de rápidos resultados são os de maior interesse Dessa forma, a transformação via A rhizogenes torna-se um método rápido para a obtenção de plantas contendo raízes transformadas, além de se mostrar eficiente em estudos de superexpressão e/ou silenciamento de genes relacionados a estresses causados por fitopatógenos de raízes Alguns protocolos têm sido adaptados em soja, mas há limitações na eficiência de transformação, levando a um reduzido número de plantas em bom estado para a condução de bioensaios Neste trabalho, o método de transformação de raízes de soja com A rhizogenes foi otimizado permitindo uma elevação significativa na eficiência na transformação e recuperação de plantas transformadas, visando sua aplicação em estudos envolvendo a interação da soja com nematoides Após a adição de uma etapa de recuperação via hidroponia e alteração no processo de seleção com a retirada do antibiótico higromicina, foi obtida uma taxa de 55% de eficiência de transformação As análises de RNAm conduzidas via RT-qPCR são amplamente utilizadas para a validação do perfil de expressão gênica, uma vez que constitui uma metodologia muito sensível, especifica, rápida e com boa reprodutibilidade Tais análises necessitam do emprego de genes normalizadores, cujo níveis de expressão permaneçam invariáveis entre os diferentes órgãos, estágios de desenvolvimento e tratamento em estudo Desse modo, tais normalizadores são indispensáveis à precisão da quantificação da expressão gênica, eliminando variações devido à quantidade inicial de cDNA adicionado nas reações, garantindo que apenas as variações na expressão dos genes sejam consideradas Neste trabalho sete genes comumente utilizados como normalizadores em ensaios de RT-qPCR (GmELF1-a, GmELF1-ß, GmTUA, GmTUB, Gmß-actina, GmGAPDH e o GmRNAr18S) foram avaliados quando à estabilidade de expressão em raízes transformadas via A rhizogenes, submetidas à infecção com M javanica, nos períodos de inoculação de 8 e 5 dpi (dias após inoculação), a fim de identificar os melhores normalizadores sob tais condições Os genes GmELF1-ß e GmELF1-a foram os mais estáveis em todas as análises comparativas enquanto o gene GmGAPDH foi o que apresentou menor estabilidade
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in addition it is efficient to overexpression genes related to stresses caused by root’s phytopathogens Some protocols have been adapted, but there are limitations on the transformation efficiency, causing a reduction on the amount of plants in good condition obtained for conducting bioassays with nematodes In this work the method of transformation of soybean roots with A rhizogenes was optimized allowing a significant increase in efficiency in the processing and recovery of transformed plants, for their application in studies involving the interaction of soybean and nematodes After addition of a recovery step by hydroponic and changing the selection process with the exclusion of hygromycin antibiotic a rate of 55% transformation efficiency was obtained The mRNA analyzes conducted by RT-qPCR are widely used for the validation profile of gene expression, since it is a very sensitive, specific, fast and with good reproducibility method These analyzes require the use of housekeeping genes whose expression levels remain unchanged between the different organs, developmental stages and study treatment Thus, normalizing is essential to the accuracy of quantification expression gene, eliminating variation due to the initial amount of cDNA added to the reaction, ensuring that only changes in gene expression are considered In this work seven genes commonly used as a housekeeping gene in RT-qPCR assays (GmELF1-a, ß-GmELF1, GmTUA, GmTUB, Gmß-actin, and GmGAPDH GmRNAr18S) were evaluated the stability of expression in transformed and untransformed roots via A rhizogenes, subject to infection with Meloidogyne javanica, during periods of inoculation 8 and 5 dpi (days after inoculation) in order to identify the best normalizing genes under such conditions The GmELF1-ß and GmELF1 -a genes were the most stable in all benchmarks, while the GmGAPDH gene showed the lowest stabilityMarcelino-Guimarães, Francismar Corrêa [Orientador]Moreira, Renata StolfCarvalho, Mayra da Cruz Costa Gallo deKuma, Kátia Miki2024-05-01T14:45:28Z2024-05-01T14:45:28Z2014.0011.12.2014info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/15155porMestradoBiotecnologiaCentro de Ciências ExatasPrograma de Pós-graduação em BiotecnologiaLondrinareponame:Repositório Institucional da UELinstname:Universidade Estadual de Londrina (UEL)instacron:UELinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-07-12T04:20:06Zoai:repositorio.uel.br:123456789/15155Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.bibliotecadigital.uel.br/PUBhttp://www.bibliotecadigital.uel.br/OAI/oai2.phpbcuel@uel.br||opendoar:2024-07-12T04:20:06Repositório Institucional da UEL - Universidade Estadual de Londrina (UEL)false
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