Citotoxicidade de micropartículas de poliméricas mucoadesivas para liberação controlada de nistatina

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bisetto, Paula
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPG
Texto Completo: http://tede2.uepg.br/jspui/handle/prefix/3170
Resumo: Micropartículas (MPs) poliméricas para liberação controlada de nistatina (N) foram testadas em relação a citototoxicidade nas suas concentrações inibitórias mínimas (CIM50 e CIM80 contra C. albicans) in vitro, pelos métodos Alamar Blue® e MTT. As MPs foram obtidas com os polímeros Eudragit L-100® (E), Gantrez MS-955® (G) ou da combinação de ambos (EG), acrescidos deN 10% ou a 20%. Queratinócitos humanos (NOK) foram proliferados in vitro e semeados (2 X 104cél/mL), em meio de cultura DEMEM com 10% de soro fetal bovino em placas de 96 orifícios e incubados durante 24 h, para semiconfluência. O meio de cultura foi substituído por meio novo (200 µl) contendo 2 µl de soluções-mãe, em DMSO, dos materiais estudados, para atingir as CIMs, conformando os grupos experimentais: GN1050, GN1080; GN2050, GN2080, EN1050, EN1080, EN2050, EN2080, EGN1050, EGN1080, EGN2050, EGN2080 (todas MPs com N) e G0 e E0 (MPs brancas, sem fármaco). O solvente também foi avaliado a 1% (grupo DMSO). Como grupo controle (C), foram cultivadas células que receberam somente o meio de cultura (100% de crescimento). Juntamente com os tratamentos, 20 µl do reagente Alamar Blue® foram adicionados aos poços contendo as células, que foram incubadas por 24 h. Leituras de fluorescência foram realizadas em 6 h, 12 h e 24 h (emissão de 544 nm e 590 nm de transmissão). No teste de MTT, o reagente foi inserido ao término do período de incubação com os tratamentos (24 h). Para isso, as células foram lavadas com PBS e receberam 200 µl de MTT a 0,5 mg/mL, foram seladas e voltaram à estufa por 4 h. A solução foi descartada e os cristais de formazan solubilizados em 200 µl de metanol, por 5 min. O sobrenadante foi lido a 570 nm. Os testes foram realizados em triplicata e em três ocasiões. As medidas de fluorescência ou de absorbância foram calculadas como porcentagem de inibição de atividade metabólica comparadas ao controle e classificadas qualitativamente. Os dados também foram analisados pelo teste Shapiro-Wilk, que mostrou distribuição não normal. Os testes complementares usados foram Kruskall Wallys e Friedman (α =0,05). Na análise qualitativa de citotoxicidade das leituras de fluorescência das diferentes MPs, nenhuma delas foi classificada como moderada ou altamente citotóxica. Na análise quantitativa inferencial, não houve diferença estatisticamente significativa entre a maior parte dos grupos avaliados nos períodos de tempo testados, mostrando um comportamento semelhante para a maioria das MPs, exceto as partículas EN2050, G050 e GN1050, que se apresentaram levemente citotóxicas no tempo de 6h. Nas leituras de absorbância, na análise qualitativa, as MPs apresentaram comportamento levemente ou não citotóxico. Já na análise quantitativa, as MPs mostraram diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle, mas não entre si. A MP GN1080 se apresentou não citotóxica em todos os testes. De acordo com os testes realizados no presente estudo, pode-se concluir que nenhuma MP testada foi classificada como moderada ou altamente citotóxica in vitro.
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Queratinócitos humanos (NOK) foram proliferados in vitro e semeados (2 X 104cél/mL), em meio de cultura DEMEM com 10% de soro fetal bovino em placas de 96 orifícios e incubados durante 24 h, para semiconfluência. O meio de cultura foi substituído por meio novo (200 µl) contendo 2 µl de soluções-mãe, em DMSO, dos materiais estudados, para atingir as CIMs, conformando os grupos experimentais: GN1050, GN1080; GN2050, GN2080, EN1050, EN1080, EN2050, EN2080, EGN1050, EGN1080, EGN2050, EGN2080 (todas MPs com N) e G0 e E0 (MPs brancas, sem fármaco). O solvente também foi avaliado a 1% (grupo DMSO). Como grupo controle (C), foram cultivadas células que receberam somente o meio de cultura (100% de crescimento). Juntamente com os tratamentos, 20 µl do reagente Alamar Blue® foram adicionados aos poços contendo as células, que foram incubadas por 24 h. Leituras de fluorescência foram realizadas em 6 h, 12 h e 24 h (emissão de 544 nm e 590 nm de transmissão). No teste de MTT, o reagente foi inserido ao término do período de incubação com os tratamentos (24 h). Para isso, as células foram lavadas com PBS e receberam 200 µl de MTT a 0,5 mg/mL, foram seladas e voltaram à estufa por 4 h. A solução foi descartada e os cristais de formazan solubilizados em 200 µl de metanol, por 5 min. O sobrenadante foi lido a 570 nm. Os testes foram realizados em triplicata e em três ocasiões. As medidas de fluorescência ou de absorbância foram calculadas como porcentagem de inibição de atividade metabólica comparadas ao controle e classificadas qualitativamente. Os dados também foram analisados pelo teste Shapiro-Wilk, que mostrou distribuição não normal. Os testes complementares usados foram Kruskall Wallys e Friedman (α =0,05). Na análise qualitativa de citotoxicidade das leituras de fluorescência das diferentes MPs, nenhuma delas foi classificada como moderada ou altamente citotóxica. Na análise quantitativa inferencial, não houve diferença estatisticamente significativa entre a maior parte dos grupos avaliados nos períodos de tempo testados, mostrando um comportamento semelhante para a maioria das MPs, exceto as partículas EN2050, G050 e GN1050, que se apresentaram levemente citotóxicas no tempo de 6h. Nas leituras de absorbância, na análise qualitativa, as MPs apresentaram comportamento levemente ou não citotóxico. Já na análise quantitativa, as MPs mostraram diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle, mas não entre si. A MP GN1080 se apresentou não citotóxica em todos os testes. De acordo com os testes realizados no presente estudo, pode-se concluir que nenhuma MP testada foi classificada como moderada ou altamente citotóxica in vitro.Polymeric microparticles (MPs) for controlled release of nystatin (N) were tested for cytototoxicity at their MIC50 and MIC80 against C. albicans in vitro, by the Alamar Blue® and MTT methods. The MPs obtained with the polymers Eudragit L-100® (E), Gantrez MS-955® (G) or the combination of both (EG), plus N 10% or 20%.Human keratinocytes (NOK) were proliferated in vitro and seeded (2 X 104 cells / mL), in DEMEM culture medium with 10% fetal bovine serum in 96-well plates and incubated for 24 h for semiconfluency. Then, the culture medium was replaced with new medium (200 µl) containing 2 µl of stock solutions, in DMSO, of the studied materials, to reach the MICs, conforming the experimental groups: GN1050, GN1080; GN2050, GN2080, EN1050, EN1080, EN2050, EN2080, EGN1050, EGN1080, EGN2050, EGN2080 (all MPs with N) and G0 and E0 (white MPs, without drug). The solvent was also evaluated at 1% (DMSO group). As a control group (C), cells were cultured that received only the culture medium (100% growth). Along with the treatments, 20 µl of the Alamar Blue® reagent were added to the wells containing the cells, which were incubated for 24 h. Fluorescence readings were taken at 6, 12 and 24 h (emission of 544 nm and 590 nm of transmission). In the MTT test, the reagent was inserted at the end of the incubation period with the treatments (24 h). For this, the cells were washed with PBS and received 200 µl of MTT at 0.5 mg / mL, sealed and returned to the oven for 4 h. The solution was discarded and the formazan crystals solubilized in 200 µl of methanol, for 5 min. The supernatant was read at 570 nm. The tests were carried out in triplicate and on three occasions. The fluorescence or absorbance measurements were calculated as a percentage of inhibition of metabolic activity compared to the control and classified qualitatively. The data were analyzed using the Shapiro-Wilk test, which showed a non normal distribution. The factors considered were material (independent, ten levels), MIC (dependent, two levels: 50/80) and incubation time (only Alamar Blue®, dependent, three levels). The complementary tests used were Kruskall-wallys and Friedman. Significant difference was considered with p˂0.05 values. The qualitative analysis of cytotoxicity of the different MPs showed that in the fluorescence readings, no MP showed moderate or highly cytotoxic behavior. In the quantitative analysis, there was no significant difference between the groups evaluated in the periods of time tested, showing a similar behavior for the MPs. In the absorbance readings, in the qualitative analysis, the MPs also showed a mild or non-cytotoxic behavior. In the quantitative analysis, the MPs showed a significant difference in relation to the control group, but not between them. MP GN1080 was found to be non-cytotoxic in all tests. No MP showed moderate or high cytotoxicity.Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2020-08-18T00:27:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Paula Bisetto.pdf: 811231 bytes, checksum: c05842e80282dc1e3fa038f5df7a610f (MD5)Made available in DSpace on 2020-08-18T00:27:48Z (GMT). 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