Construção de novos promotores funcionais em Escherichia coli por meio de síntese química de DNA randomizada

• Autor(a) principal: Moreira, Diego da Silva
• Data de Publicação: 2016
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/4491316744815814
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM
• Texto Completo: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/5748
• topic: Síntese Química de DNA; Regulação da Expressão Gênica; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

O interesse por ferramentas de manipulação genética que aumentem a produção de proteínas heterólogas para fins biotecnológicos, especialmente proteínas terapêuticas e enzimas industriais, aumentou significativamente em nível mundial. Para a produção de proteínas heterólogas a escolha do sistema hospedeiro & vetor de expressão é fundamental. Para a construção de uma biblioteca de promotores reguláveis e funcionais em E. coli, dois desoxi-oligonucleotídeos com regiões degeneradas foram produzidos por meio de síntese química randômica de DNA. Para a obtenção dos promotores dupla-fita, as sequências do operador Lac foram aneladas e submetidas por tratamento com a enzima Klenow. Para a clonagem e análise da funcionalidade dos novos promotores, as bordas dos desoxi-oligonucleotídeos dupla-fita e do vetor foram digeridas com BamHI e HindIII e após foram purificados. Os promotores sintéticos foram a seguir ligados ao vetor caça-promotores pKK232-8 de forma que ficassem em posição adequada para expressar o gene repórter CAT. Os plasmídeos recombinantes foram então introduzidos em E. coli DH5α F’Iq e as células transformantes foram obtidas e classificadas de acordo com o tamanho da colônia em placas de Petri contendo diferentes concentrações de cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Após as análises das colônias foram escolhidos 42 clones recombinantes, seus DNAs plamidiais extraídos e as sequências dos seus promotores determinadas completamente. A seguir 6 plasmídeos recombinantes foram reintroduzidos em E. coli DH5α F’Iq e os clones selecionados em cloranfenicol, com ou sem IPTG. Destes 6 clones, 4 foram escolhidos para analisar o crescimento em meio líquido com cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Todos os clones recombinantes em E. coli demonstraram capacidade de crescer em meio líquido, sendo que 3 deles cresceram melhor com IPTG indicando que seus promotores estão sendo regulados. O outro clone não teve seu crescimento afetado pelo indutor, confirmado pela deficiência da sequência do operador Lac. Os resultados mostram que a metodologia utilizada para gerar e clonar novos promotores funciona e que os novos promotores têm potencialidade de serem utilizados para o desenvolvimento de novos, potentes e regulados vetores de expressão.