Microevolução in vitro do vírus dengue, sorotipo-4: estudo de variações genéticas associadas ao aumento da competência viral

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Autor(a) principal: Nascimento, Valdinete Alves do
Data de Publicação: 2014
Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/5981077525371824
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM
Texto Completo: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/4903
Resumo: O vírus Dengue (DENV) pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, sendo reconhecidos quatro sorotipos distintos denominados DENV-1 a DENV-4. Assim como os demais vírus RNA, o DENV exibe variação em suas sequências, com uma taxa de erro durante o ciclo de replicação estimada em 10-3 a 10-5 erros/nucleotídeo. Essas variações são observadas não só quando analisadas amostras de diferentes indivíduos, mas também dentro de um mesmo hospedeiro. Considerando a necessidade de uma maior compreensão dos mecanismos relacionados ao processo evolutivo do DENV e a emergência de subpopulações virais, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a microevolução in vitro do vírus dengue, sorotipo-4, analisando a existência de variações genéticas associadas ao aumento da competência viral (viral fitness). Para tanto, uma amostra do DENV-4 denominada BR005AM_2015 foi inoculada em células C6/36, sendo realizadas passagens seriadas do vírus nesta linhagem celular até a passagem 25. Finalizadas as passagens, foi realizada extração do RNA viral e o cDNA foi produzido utilizando iniciador específico para DENV-4. O genoma completo da amostra BR005AM_2015 e das passagens 1, 5, 10, 15, 20 e 25 foi obtido pelo método Sanger utilizando sequenciador automático ABI 3130 genetic analyzer e por meio de sequenciamento de nova geração (NGS) utilizando a tecnologia Ion Torrent no equipamento Ion PGM™ System. Os arquivos gerados após as reações de sequenciamento foram analisados utilizando o software Geneious versão 7.1.7. A análise dos dados fornecidos pelo sequenciamento de Sanger mostrou que no decorrer das passagens ocorreram duas substituições de nucleotídeos, sendo uma na região codificante para a proteína do envelope que resultou na substituição de um resíduo de aminoácido e outra na região da proteína NS1, porém esta foi uma mutação silenciosa. Os resultados do NGS corroboraram com os obtidos pelo sequenciamento de Sanger e apresentaram outras dezessete mutações não observadas pelo método anterior, sendo as mesmas nas regiões codificantes para as proteínas E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Do total de mutações observadas, seis delas resultaram em substituição de resíduo de aminoácido. Considerando as mutações observadas, realizamos o estudo de cinética viral por RT-qPCR utilizando o método de ΔΔCt que indicou um aumento do número de cópias de RNA viral, dependente do tempo pós-infecção, tanto presente no sobrenadante de células infectadas quanto no interior das células, indicando um possível aumento da competência viral. Outros estudos se tornam necessários para confirmar se as mutações aqui encontradas também ocorrem em células de mamíferos e em sistemas in vivo, de maneira a verificar se o aumento do fitness viral observado neste estudo se repete em outros sistemas.
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Considerando a necessidade de uma maior compreensão dos mecanismos relacionados ao processo evolutivo do DENV e a emergência de subpopulações virais, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a microevolução in vitro do vírus dengue, sorotipo-4, analisando a existência de variações genéticas associadas ao aumento da competência viral (viral fitness). Para tanto, uma amostra do DENV-4 denominada BR005AM_2015 foi inoculada em células C6/36, sendo realizadas passagens seriadas do vírus nesta linhagem celular até a passagem 25. Finalizadas as passagens, foi realizada extração do RNA viral e o cDNA foi produzido utilizando iniciador específico para DENV-4. O genoma completo da amostra BR005AM_2015 e das passagens 1, 5, 10, 15, 20 e 25 foi obtido pelo método Sanger utilizando sequenciador automático ABI 3130 genetic analyzer e por meio de sequenciamento de nova geração (NGS) utilizando a tecnologia Ion Torrent no equipamento Ion PGM™ System. Os arquivos gerados após as reações de sequenciamento foram analisados utilizando o software Geneious versão 7.1.7. A análise dos dados fornecidos pelo sequenciamento de Sanger mostrou que no decorrer das passagens ocorreram duas substituições de nucleotídeos, sendo uma na região codificante para a proteína do envelope que resultou na substituição de um resíduo de aminoácido e outra na região da proteína NS1, porém esta foi uma mutação silenciosa. Os resultados do NGS corroboraram com os obtidos pelo sequenciamento de Sanger e apresentaram outras dezessete mutações não observadas pelo método anterior, sendo as mesmas nas regiões codificantes para as proteínas E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Do total de mutações observadas, seis delas resultaram em substituição de resíduo de aminoácido. Considerando as mutações observadas, realizamos o estudo de cinética viral por RT-qPCR utilizando o método de ΔΔCt que indicou um aumento do número de cópias de RNA viral, dependente do tempo pós-infecção, tanto presente no sobrenadante de células infectadas quanto no interior das células, indicando um possível aumento da competência viral. Outros estudos se tornam necessários para confirmar se as mutações aqui encontradas também ocorrem em células de mamíferos e em sistemas in vivo, de maneira a verificar se o aumento do fitness viral observado neste estudo se repete em outros sistemas.Dengue virus (DENV) belongs to the family Flaviviridae and the genus Flavivirus, being recognized as four distinct serotypes termed DENV-1 to DENV-4. Like other RNA viruses, DENV displays variation in their sequences, with an error rate during replication cycle estimated at 10-3 to 10-5 errors / nucleotide. These variations are observed not only when samples from different individuals are analyzed, but also within the same host. Considering the need for a better understanding of related mechanisms of DENV evolutionary process and the emergence of viral subpopulations, this study aimed to evaluate the in vitro microevolution of dengue virus serotype-4, analyzing the existence of genetic variations associated with increased viral fitness. For this purpose, a sample of DENV-4 called BR005AM_2015 was inoculated in C6/36 cells and 25 serial passages were performed. After these passages, viral RNA extraction was performed and the cDNA was produced using a specificDENV-4 primer. The full-length genome of the sample BR005AM_2015 and passages 1, 5, 10, 15, 20 and 25 were obtained by the Sanger method using the ABI 3130 Genetic Analyzer and by Next-Generation Sequencing (NGS) using the Ion Torrent technology. The files generated after the sequencing reactions were analyzed using Geneious software version 7.1.7. The analysis of the data provided by the Sanger sequencing has shown that during the 25 passages, two nucleotide mutations occurred, one in the region which encodes for the envelope protein, resulting in the substitution of an amino acid residue T501P, and other silent mutation at NS1 gene. The results of NGS corroborate those obtained by Sanger sequencing. Moreover, seventeen other mutations not previously observed, being the same in the coding regions for proteins E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5. Of the total observed mutations, six of them led to residue substitution. Considering the observed amino acids substitutions, we conducted a study of viral kinetics by RT-qPCR using the ΔΔCt method which indicated a time-dependent increase in the number of copies of viral RNA present in both the supernatant or inside the infected cells, indicating a possible increase of the viral fitness. Other studies are necessary to confirm if the mutations described here also occurs in mammalian cells or in vivo systems, as well as to verify if the observed increase in viral fitness occurs in other systems.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorUniversidade Federal do AmazonasFaculdade de Ciências FarmacêuticasBrasilUFAMPrograma de Pós-graduação em Saúde, Sociedade e Endemias na AmazôniaNaveca, Felipe Gomeshttp://lattes.cnpq.br/3396741165569463Nascimento, Valdinete Alves dohttp://lattes.cnpq.br/59810775253718242016-02-24T20:19:21Z2014-08-28info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfNASCIMENTO, Valdinete Alves do. Microevolução in vitro do vírus dengue, sorotipo-4: estudo de variações genéticas associadas ao aumento da competência viral. 2014. 76f. Dissertação (Mestrado em Saúde, Sociedade e Endemias na Amazônia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2014.http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/4903porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAMinstname:Universidade Federal do Amazonas (UFAM)instacron:UFAM2019-11-14T14:41:55Zoai:https://tede.ufam.edu.br/handle/:tede/4903Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://200.129.163.131:8080/PUBhttp://200.129.163.131:8080/oai/requestddbc@ufam.edu.br||ddbc@ufam.edu.bropendoar:65922019-11-14T14:41:55Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM - Universidade Federal do Amazonas (UFAM)false
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