Produção de proinsulina recombinante em Pichia pastoris utilizando o promotor do gene PGK

• Autor(a) principal: Assunção, Enedina Nogueira de
• Data de Publicação: 2015
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/0502304950499185
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM
• Texto Completo: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/5228
• topic: Proinsulina; Codóns otimizados; Vetor de expressão; Promotor PGK; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

De acordo com os indicadores da Organização Mundial de Saúde (OMS) o diabetes mellitus deve alcançar 333 milhões de pessoas em 2025 no mundo e em 2030 na América Latina será a segunda causa de morte, por isso o aumento da produção de insulina torna-se uma necessidade para suprir as futuras demandas de mercado. Os sistemas de expressão em leveduras tipo Pichia pastoris tem sido cada vez mais utilizados e tem-se mostrado como atraentes alternativas para a expressão de proteínas para fins industriais. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo principal a produção de proinsulina humana por Pichia pastoris utilizando o promotor do gene PGK. O gene A1 que codifica o precursor da insulina foi sintetizado quimicamente com codóns otimizados para a expressão em P. pastoris. Esse gene foi clonado em vetor de expressão/secreção sob controle do promotor PGK de P. pastoris e integrado no genoma de P. pastoris GS115. A produção de proinsulina recombinante foi realizada em meio líquido YPD em frascos agitados a 30°C, a 180 rpm. A análise da proinsulina expressa em P. pastoris foi realizada por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida e Western-blotting e mostrou massa molecular de aproximadamente 7,5 kDa. O clone recombinante A140 que apresentou maior resistência a zeocina e sinal positivo mais intenso no imunodot-blotting foi utilizado para estabelecer condições melhores de expressão/secreção de proinsulina em planejamento fatorial estatístico experimental. As condições de cultivo que se mostraram melhores para a produção da proinsulina foram: composição do meio de cultivo (dextrose 7,5%, extrato de levedura 1% e peptona 0,15%), temperatura de 25°C e pH do meio igual a 7,0. O clone A140 nas melhores condições de cultivo atingiu biomassa total de 50g/L e nível de expressão de insulina de 0,83g/L em 72 horas de cultivo. A expressão de proinsulina em altos níveis utilizando o promotor PGK em P. pastoris faz esse sistema de expressão atrativo para produção da proinsulina humana e outras proteínas de interesse industrial.