Construção de vetores de expressão para Escherichia coli baseados em promotores ativos na fase estacionária de crescimento

• Autor(a) principal: Wöhlke, Jonathan Luiz
• Data de Publicação: 2012
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/3114678857795184
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM
• Texto Completo: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/3090
• topic: Vetores de expressão; Escherichia coli; Promotores; Fase estacionária; GFP; Expression vectors; Escherichia coli; Promoters; Stationary phase, GFP; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Plasmídeos são elementos genéticos extracromossomais, que no geral não são essenciais para a sobrevivência da bactéria, entretanto, conferem vantagens peculiares (como resistência à antibióticos) para o organismo. Para engenharia genética, plasmídeos de ocorrência natural têm sido modificados extensivamente para produção de vetores com as características desejadas. Promotores são elementos de um vetor que podem ter um profundo efeito na força e duração da transcrição, e consequentemente, no rendimento proteico. A síntese de mRNA inicia quando a RNA polimerase se liga a sequência promotora , adjacente ao gene alvo. Fatores sigma são proteínas que regulam a transcrição em bactérias, e os mesmos podem ser ativados em diferentes condições ambientais. O fator sigma (S) é visto como um regulador mestre de resposta ao estresse geral, codificado a partir do gene RpoS na fase estacionária tardia. Este fator é o regulador primário dos genes de fase estacionária. Promotores baseados em reguladores metabólicos de fase estacionária representam uma classe de promotores controlados metabolicamente e que podem ser explorados para o design de vetores de expressão. Neste projeto foram desenvolvidos três cassetes de expressão para a construção de vetores de expressão, os quais possuem promotores com afinidade pelo fator sigma S, com o objetivo de avaliar o perfil de expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli. Para a avaliação da força dos promotores e do perfil de expressão, utilizou-se a proteína verde fluorescente (GFP) como gene repórter. Os três vetores construídos, os quais foram denominados de p26, p53 e pFS expressaram a GFP com a correta formação do fluoróforo, sendo que os vetores p26 e p53 apresentaram superexpressão da proteína recombinante, quando comparados ao vetor pGS21a. Ademais, observou-se que os vetores aqui construídos estão contribuindo para a redução da taxa de crescimento e filamentação da E. coli. Esta plasticidade morfológica confere à bactéria maior capacidade de armazenamento da proteína recombinante expressa.