Seleção dos clones produtores de amilases e proteases presentes na biblioteca Metagenômica de Terra Preta de Índio

• Autor(a) principal: Cruz, Carolinie Batista Nobre da
• Data de Publicação: 2010
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/2559483639062413
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM
• Texto Completo: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/3615
• topic: Metagenoma; Amilase; Protease; Enzimas; Fosmídeo; Clones; Biblioteca Metagenômica - Terra Preta de Índio; Metagenomic; Amylase; Protease enzymes; Fosmid; CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Na floresta Amazônica são encontrados solos agricultáveis denominado de solo de Terra Preta de Índio (TPI), um solo rico em matéria orgânica e em minerais. A biodiversidade da Amazônia constitui uma fonte de valor altíssimo de micro-organismos não-cultiváveis que podem ser isolados através das construções das bibliotecas metagenômicas, utilizando vetores de grandes fragmentos, com o objetivo de encontrar novas enzimas biocatalíticas. As enzimas de maior aplicação no mercado industrial são as amilases e proteases, aplicadas nas indústrias: química, farmacêutica, têxtil, de detergentes e alimentícia. As amilases são capazes de degradar o amido em unidades de sacarídeos menores, já as proteases catalisam a hidrólise de ligações peptídicas. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar parcialmente enzimas amilolíticas e proteolíticas de clones isolados a partir de uma seleção funcional da biblioteca metagenômica de TPI da região Amazônica construída com DNA total extraído dos micro-organismos presentes nas amostras de solos de TPI, inseridos no vetor fosmidial (pCC1Fos ) e clonado na célula hospedeira Escherichia coli (EPI300). De 1.344 clones pertencente a biblioteca metagenômica, apenas 4 clones foram produtores de halo de hidrólise de amido e 3 clones foram proteolíticos, além disso, todas as enzimas produzidas pelos 4 clones amilolíticos e 1 clone proteolítico foram caracterizadas parcialmente. Após o isolamento, os clones foram inoculados em meio de cultura Luria Bertani (LB) a 37oC, sob agitação de 150 rpm e submetidos aos ensaios enzimáticos nos pHs de 3 a 10 e temperatura variando de 25 a 100ºC por até 90 minutos de incubação. As amilases tiveram sua maior produção em 24 horas (4,3 U/mL) e sua atividade ótima foi em pH neutro a levemente alcalino, o clone P1C4 demonstrou a maior produção a 70ºC (6,93 U/mL), já os clones P5C4 e P6C12 demonstraram a maior termoestabilidade a 80°C, tais resultados indicam que o gene de alfa-amilase clonado deve ser codificador de uma enzima termoestável, como por exemplo, a enzima produzida por Bacillus liqueniformis. Já o clone P3A3 produziu 26,3 U/mL de proteases em 10 horas de produção, sua atividade ótima foi em pH neutro, sendo sua temperatura ótima em 30ºC (56,0 U/mL) e sua termoestabilidade foi demonstrada em 50ºC (22,0 U/mL). Estas características contribuem para a aplicação destas enzimas em setores industriais como na produção de alimentos, indústria química e produção de detergentes. As enzimas isoladas neste trabalho demonstraram características e atuações novas quando comparadas a enzimas descritas atualmente, a qual comprova a eficiência da construção de bibliotecas metagenômicas para o isolamento de novos bioprodutos.