rBmTI-A : um versátil inibidor de serinoproteases, termoestável e com ação anti-inflamatória em células pulmonares A549

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Ferreira, Graziele Cristina
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFABC
Texto Completo: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122373
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki
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spelling rBmTI-A : um versátil inibidor de serinoproteases, termoestável e com ação anti-inflamatória em células pulmonares A549INIBIDORES DE SERINOPROTEASESINIBIDOR KUNITZ-BPTIRHIPICEPHALUS MICROPLUSrBmTI-ATERMOESTABILIDADEINFLAMAÇÃOCÉLULAS A549CITOCINASRECEPTOR ATIVADO POR PROTEASE (PAR)ELASTASE PANCREÁTICA PORCINAELASTASE DE NEUTRÓFILOS HUMANASERINEPROTEASESKUNITZ-BPTI INHIBITORTHERMOSTABILITYINFLAMMATIONA549 CELLSCytokinesPROTEASE-ACTIVATED RECEPTOR (PAR)PORCINE PANCREATIC ELASTASEHUMAN NEUTROPHIL ELASTASEPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOSSISTEMAS - UFABCOrientador: Prof. Dr. Sergio Daishi SasakiTese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, Santo André, 2021.O inibidor de serinoproteases rBmTI-A é uma proteína recombinante baseada em um inibidor originário do carrapato Rhipicephalus microplus, pertence à família Kunitz-BPTI, é constituído de dois domínios inibitórios e tem atividade sobre elastase de neutrófilos humana (HNE), tripsina bovina, plasmina e Calicreína Plasmática Humana. Em trabalho anterior de indução do enfisema pulmonar com elastase pancreática porcina (PPE) em camundongos, o inibidor mostrou prevenção da instalação do enfisema em comparação com o grupo não tratado com redução da resposta inflamatória. No presente trabalho, inicialmente, realizamos a expressão e purificação de rBmTI-A e comprovamos a estabilidade térmica do inibidor. Também foi demonstrado que rBmTI-A consegue inibir PPE, KLK5, e KLK7 com Ki na faixa de nM. Em seguida analisamos a resposta inflamatória induzida por PPE em células pulmonares humanas A549 e investigamos a ação do rBmTI-A nesse processo; além disso, analisamos o envolvimento dos receptores ativados por protease (PAR) no aumento de citocinas decorrente da ação da PPE. Para isso, as células foram incubadas com diferentes concentrações de rBmTIA por duas horas seguido da adição de PPE (0,0125 U/mL), foram feitos controles apenas incubando as células com meio, PPE ou inibidor, após 16 horas, os sobrenadantes foram destinados para quantificação de citocinas inflamatórias por ELISA ou ensaio Multiplex, enquanto que as células foram submetidas à ensaio de viabilidade celular por MTT ou extração de RNA e posterior qPCR para análise de transcrição de citocinas inflamatórias. Procedimento semelhante foi realizado com o uso de peptídeos antagonistas PAR-1 e PAR-2 incubados por 30 minutos seguido da adição de PPE (0,0125 U/mL). Como resultados verificamos que a PPE na concentração de 0,0125 U/mL não alterou a viabilidade celular e promoveu aumento de expressão relativa de citocinas inflamatórias. rBmTI-A em uma concentração de 8 nM promoveu diminuição de citocinas expressas em comparação com o grupo induzido com PPE, com níveis de IL-8, IL-6, MCP-1 e TNF-? reduzidos em 56%, 20%, 45% e 64%, respectivamente. Com relação à secreção de citocinas no sobrenadante, rBmTI-A na concentração de 8 nM reduziu 50% de níveis de IL-8 e 75% de níveis de MCP-1. IL-10, por outro lado, não foi detectada por qPCR nem no ensaio Multiplex. Os antagonistas PAR-1 e PAR-2 a 50 ?M foram suficientes para reduzir a expressão gênica e secreção de IL-8 nas células estimuladas com PPE, apresentando níveis próximos ao controle. Por meio dos resultados de análise das citocinas no modelo experimental em células A549, concluímos que o tratamento com rBmTI-A pode diminuir o processo inflamatório causado pela ação de PPE nessa linhagem celular, e, adicionalmente, sugerimos que o aumento dessas citocinas, principalmente de IL-8, está ligado a ação de PPE nos receptores PAR-1 e PAR-2.The serine protease inhibitor rBmTI-A is a recombinant protein based on an inhibitor from the tick Rhipicephalus microplus, it belongs to Kunitz-BPTI family with two inhibitors domains and present activity on human neutrophil elastase (HNE), bovin trypsin, plasmin and human plasma kallikreins. In a previous work, pulmonary emphysema was induced by porcine pancreatic elastase (PPE) in mice and the inhibitor was capable to prevent emphysema development when compared to the untreated control with reduction of the inflammatory response. In this work, initially, we produced rBmTI-A and demonstrated its thermostability, also we showed that rBmTI-A inhibit PPE, KLK5, and KLK7 with Ki in nM range. As follow, we analyzed the inflammatory response induced by PPE in A549 human pulmonary cells and investigated the action of rBmTI-A in this process, furthermore, we analyzed the involvement of protease-activated receptor (PAR) in cytokine increase resulting from the action of PPE. The cells were incubated with rBmTI-A in different concentrations for two hours followed by addition of PPE (0.0125 U/mL), controls were made only incubating the cells with medium, PPE or inhibitor; after 16 hours, the supernatants were destined to inflammatory cytokines quantification by ELISA or Multiplex while the cells were submitted to cell viability assay by MTT or RNA extraction and then qPCR for analysis of inflammatory cytokine transcription. Similar procedure was accomplished with antagonist peptides PAR-1 and PAR-2 incubated for 30 minutes followed by addition of PPE (0.0125 U/mL). Our results showed that PPE at a concentration of 0.0125 U/mL did not alter the cellular viability and promoted an increase of relative expression of inflammatory cytokines. rBmTI-A at 8 nM promoted decrease of expressed cytokines in comparison with the induced PPE group with level of IL-8, IL-6, MCP- 1 and TNF-? reduced in 56%, 20%, 45% and 64%, respectively. Concerning cytokines secretion in supernatant, rBmTI-A at 8 nM reduced 50% of IL-8 release and 75% of MCP-1 release. IL- 10, on the other hand, was not detected neither by qPCR nor by Multiplex tests. The PAR-1 and PAR-2 antagonist at 50 ?M were enough to reduce the genetic expression and secretion of IL-8 in PPE stimulated cells, presenting similar levels to the control. Through the results obtained in this work, we conclude that the treatment with rBmTI-A can decrease the inflammatory process induced by PPE in A549 cells and, additionally, we suggest that these cytokines increase, mainly IL-8, is connected to the action on PAR-1 and PAR-2 receptors.Sasaki, Sergio DaishiGalvão, Ana Carolina Santos de SouzaTanaka, Aparecida SadaeToledo, Erika Suzuki deOliveira, Vinicius de AndradeFerreira, Graziele Cristina2021info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf134 f. : il.http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122373http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122373&midiaext=79720http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122373&midiaext=79719Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.br/php/capa.php?obra=122373porreponame:Repositório Institucional da UFABCinstname:Universidade Federal do ABC (UFABC)instacron:UFABCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-06-06T12:42:26Zoai:BDTD:122373Repositório InstitucionalPUBhttp://www.biblioteca.ufabc.edu.br/oai/oai.phpopendoar:2022-06-06T12:42:26Repositório Institucional da UFABC - Universidade Federal do ABC (UFABC)false
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Ferreira, Graziele Cristina
INIBIDORES DE SERINOPROTEASES
INIBIDOR KUNITZ-BPTI
RHIPICEPHALUS MICROPLUS
rBmTI-A
TERMOESTABILIDADE
INFLAMAÇÃO
CÉLULAS A549
CITOCINAS
RECEPTOR ATIVADO POR PROTEASE (PAR)
ELASTASE PANCREÁTICA PORCINA
ELASTASE DE NEUTRÓFILOS HUMANA
SERINEPROTEASES
KUNITZ-BPTI INHIBITOR
THERMOSTABILITY
INFLAMMATION
A549 CELLS
Cytokines
PROTEASE-ACTIVATED RECEPTOR (PAR)
PORCINE PANCREATIC ELASTASE
HUMAN NEUTROPHIL ELASTASE
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