Caracterização das propriedades bioquímicas, estruturais, edematogênicas e pró-oxidantes de sPLA2 clonadas e expressas em comparação com sPLA2 nativas purificadas do veneno de Crotalus durissus terrificus

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Belchor, Mariana Novo
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFABC
Texto Completo: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=126165
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Marcos Hikari Toyama
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Dentre os componentes presentes, a fosfolipase A2 (PLA2) é a toxina enzima desencadeia o processo inflamatório, liberando ácido araquidônico e lisofosfolipídios. Deste modo, a busca por novos compostos capazes de inibir esta proteína, poderiam auxiliar na descoberta de um coadjuvante para a soroterapia, e também para o desenvolvimento de drogas anti-inflamatórias, fatores que fizeram parte do objetivo geral deste trabalho. Para atingir esse objetivo, foi realizada a clonagem e expressão da PLA2 de Cdt, através da expressão heteróloga, a fim obter a proteína em grandes quantidades para a produção de uma coluna de bioafinidade. Além disso, ferramentas in sílico para a análise de compostos e para o estudo da interação dos compostos com a proteína foram utilizados. Para as análises físico-químicas dos compostos, as plataformas SwissADME, Molinspiration e ChEMBL foram utilizadas, e para as docagens, o AutoDockTools foi executado para a preparação das moléculas e o AutoDock Vina, para as análises de ancoragem da proteína e dos compostos. Como resultado da primeira etapa, obteve-se uma baixa expressão, e a PLA2 passou a ser obtida pela metodologia original, ou seja, através da purificação veneno. A partir deste ponto, foram escolhidos compostos já estudados anteriormente, a Quercetina (Q), Rhamnetina(Rhm), 3-O-metilquercetina (3MQ) e Rhamnazina, contra a ação da atividade enzimática da PLA2 de Cdt. Estes compostos revelaram atividade antiinflamatória contra a mesma proteína de Bothrops jararacussu (Bj), portanto, a hipótese inicial seria de que estes compostos também inibissem esta toxina de Cdt. Os resultados mostraram que 3MQ foi o composto que melhor inibiu a atividade enzimática da PLA2 de Cdt e apresentou maior interação com o sítio ativo da proteína no docking molecular. Ligações de hidrogênio foram observadas entre 3MQ, Rhm, Q e a proteína, enquanto apenas interações hidrofóbicas foram observadas com a Rhz, composto que não mostrou inibição. Análises in sílico também foram realizadas com a PLA2-Asp49 de Bothrops jararacussu, a BthTX-II, mostrando que com o análogo foram observadas interações por ligação de hidrogênio com a Gly 32 e 33 e Thr23, além de exibir interações hidrofóbicas com a Asp49, Tyr28 e Cys29, e interações semelhantes foram observadas nos compostos Q, Rhz e 3MQ. Entretanto, Rhm, que já havia revelado seu potencial antimiotóxico em outro estudo, mostrou interações na interface do dímero. Além disso, com a BthTX-I, Rhm mostrou maiores interação na interface do dímero, sugerindo que este pode ser um potencial inibidor da miotoxicidade desta macromolécula. Apesar de não terem sido descobertos novos compostos, neste trabalho foi possível analisar e comparar as interações de 4 moléculas que apresentam pequenas diferenças estruturais. Estas diferenças, entretanto, levaram a níveis diferentes de inibição e interação com as diferentes pla2 dos dois venenos utilizados. Concluiu-se que a metilação pode influenciar nas interações dos compostos com diferentes tipos de fosfolipases, bem como sua afinidade pela proteína que pode mudar.Snakebites are considered a neglected tropical disease, and the most common form of treatment is the administration of specific antivenom serum, which is not capable of inhibiting all the toxins in the venom. Among the components present, phospholipase A2 (PLA2) is the toxin enzyme that triggers the inflammatory process, releasing arachidonic acid and lyso-phospholipids. Thus, the search for new compounds capable of inhibiting this protein could help in the discovery of a coadjuvant for serum therapy, and also for the development of anti-inflammatory drugs, factors that were part of the general objective of this work. To achieve this goal, the cloning and expression of PLA2 from Cdt was carried out, through heterologous expression, in order to obtain the protein in large quantities for the production of a bioaffinity column. In addition, in silico tools for the analysis of compounds and for the study of the interaction of compounds with the protein were used. For the physicochemical analyzes of the compounds, the SwissADME, Molinspiration and ChEMBL platforms were used, and for the docking, AutoDockTools was executed for the preparation of molecules and AutoDock Vina, for the analysis of protein and compounds docking. As a result of the first step, a low expression was obtained, and PLA2 was obtained by the original methodology, that is, through venom purification. From this point on, compounds already studied previously were chosen, Quercetin (Q), Rhamnetin (Rhm), 3-O-methylquercetin (3MQ) and Rhamnazine, against the action of the enzymatic activity of PLA2 of Cdt. These compounds showed anti-inflammatory activity against the same Bothrops jararacussu protein (Bj), therefore, the initial hypothesis would be that these compounds also inhibit this Cdt toxin. The results showed that 3MQ was the compound that best inhibited the enzymatic activity of PLA2 from Cdt and showed greater interaction with the active site of the protein in molecular docking. Hydrogen bonds were observed between 3MQ, Rhm, Q and the protein, while only hydrophobic interactions were observed with Rhz, a compound that showed no inhibition. In silico analyzes were also carried out with PLA2-Asp49 from Bothrops jararacussu, BthTX-II, showing that with the analogue interactions by hydrogen bonding with Gly 32 and 33 and Thr23 were observed, in addition to exhibiting hydrophobic interactions with Asp49, Tyr28 and Cys29, and similar interactions were observed in Q, Rhz and 3MQ compounds. However, Rhm, which had already revealed its antimyotoxic potential in another study, showed interactions at the dimer interface. Furthermore, with BthTX-I, Rhm showed greater interactions at the dimer interface, suggesting that this may be a potential inhibitor of the myotoxicity of this macromolecule. Although no new compounds were discovered, in this work it was possible to analyze and compare the interactions of 4 molecules that present small structural differences. These differences, however, led to different levels of inhibition and interaction with the different pla2 of the two venoms used. It was concluded that methylation can influence the interactions of compounds with different types of phospholipases, as well as their affinity for the protein that can change.Toyama, Marcos HikariOliveira, Marcos AntônioSantos Júnior, Arnaldo Rodrigues dosPassero, Luiz Felipe DominguesCosta, Nathalia de SettaSousa, Sérgio Filipe Maia deBelchor, Mariana Novo2023info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf162 f. : il.http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=126165http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=126165&midiaext=81120Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.br/php/capa.php?obra=126165porreponame:Repositório Institucional da UFABCinstname:Universidade Federal do ABC (UFABC)instacron:UFABCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-01-18T15:15:37Zoai:BDTD:126165Repositório InstitucionalPUBhttp://www.biblioteca.ufabc.edu.br/oai/oai.phpopendoar:2024-01-18T15:15:37Repositório Institucional da UFABC - Universidade Federal do ABC (UFABC)false
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