Preparação, caracterização e ensaios biológicos de biomateriais poliméricos doadores de óxido nítrico

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pelegrino, Milena Trevisan
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFABC
Texto Completo: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122002
Resumo: Orientadora: Profa. Dra. Amedea Barozzi Seabra
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spelling Preparação, caracterização e ensaios biológicos de biomateriais poliméricos doadores de óxido nítricoÓXIDO NÍTRICONANOPARTÍCULASQUITOSANAÁCIDO HIALURÔNICOS-NITROSOTIÓISIRRADIAÇÃO ULTRAVIOLETAANTITUMORALNITRIC OXIDENANOPARTICLESCHITOSANHYALURONIC ACIDS-NITROSOTHIOLSULTRAVIOLET RADIATIONANTITUMORPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOSSISTEMAS - UFABCOrientadora: Profa. Dra. Amedea Barozzi SeabraTese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, Santo André, 2020.O oxido nitrico (NO) e uma molecula de tamanho pequeno, lipofilica e desprovidade de carga que apresenta uma miriade de aplicacoes biologicas, tais como, atividade antitumoral, atividade antibacteriana e vasodilatacao. O desafio para a aplicacao de NO e a sua meia-vida relativamente curta de 1-5 s. Para superar esse desafio, o objetivo principal desse trabalho e estudar a incorporacao de moleculas doadoras de NO, em especifico os S-nitrosotiois (RSNO), em matrizes polimericas buscando tornar a liberacao do NO sustentada. Essa tese esta dividida em cinco capitulos que buscam avaliar diferentes matrizes polimericas e diferentes aplicacoes biologicas. Foram avaliadas tres matrizes polimericas diferentes, nanoparticula de quitosana (CS NPs), hidrogel de quitosana e a modificacao quimica da quitosana. Todas tem em comum a presenca de quitosana (CS) e de RSNOs, as diferencas entre elas estao relacionadas a aplicacoes que cada material se propoe em realizar. No capitulo 1, avaliaram-se as CS NPs contendo S-nitroso-MSA com objetivo de alcancar atividade antitumoral. As nanoparticulas tem demonstrado desempenho elevado no tratamento de diferentes canceres. As CS NPs foram sintetizadas por meio do metodo de gelificacao ionotropica. Em seguida, realizou-se o revestimento dessas particulas com o acido hialuronico (AH) que apresenta alta afinidade por proteinas da membrana de celulas tumorais. Os materiais foram caracterizados utilizando tecnicas fisico-quimicas e morfologicas e demonstraram formato esferico, alta estabilidade em meio aquoso e atividade antioxidante. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados pelo teste de MTT utilizando duas linhagens de celulas tumorais o carcinoma prostatico humano (PC3) e o carcinoma do colo do utero humano (HeLa). Observou-se um efeito citotoxico das nanoparticulas com um perfil dose-dependente. As nanoparticulas com o revestimento de AH apresentaram um aumento na sua citotoxicidade, em relacao a nanoparticula sem o revestimento, o que pode representar um potencial para um tratamento alvo dirigido para celulas tumorais. No capitulo 2, utilizaram-se as CS NPs contendo a S-nitrosoglutationa (GSNO) para avaliar seu potencial de entrega direcionada de NO na pele humana. Ao aplicar as nanoparticulas na epiderme de amostras de pele humana ex vivo, observou-se um aumento da concentracao de RSNOs em 32% na pele. Esse resultado indica que as GSNO-CS NPs conseguem liberar o NO e o mesmo penetra na pele humana causando o aumento dos niveis dermicos de RSNO. Ainda, avaliou-se que o efeito das nanoparticulas pode ser aumentado em conjunto com fototerapia de luz ultravioleta. No capitulo 3, avaliou-se uma formulacao de hidrogel que e bem sucedida em aplicacoes topicas. O hidrogeis foi sintetizado utilizando CS e Pluronic (CS-Hid) contendo GSNO. A adicao do Pluronic F-127 confere ao material um comportamento termoresponsivo. Analises de reologia e morfologia demonstraram um hidrogel com temperatura de gelificacao (Tgel) de 29,95 } 0,85¿C e boas propriedades mecanicas. A GSNO livre libera o NO espontaneamente, mas apresenta uma degradacao rapida. Ao incorporar a GSNO no CS-Hid, pode-se diminuir as taxas de liberacao do NO contribuindo para que a sua liberacao seja sustentada por maiores periodos de tempo. Ainda, o ensaio de difusao de GSNO realizado utilizando uma celula de xi difusao vertical mostrou que a difusao da GSNO e 60% menor apartir do CS-Hid do que a GSNO livre. Realizaram-se ensaios de viabilidade celular para avaliar a seguranca do material utilizando celulas Vero e ensaios de acao antibacteriano utilizando a Pseudomonas aeruginosa. O ensaio de citotoxicidade com as celulas Vero demonstrou que o material nao apresenta efeito citotoxico em concentracoes abaixo de 2,4 ¿Êg mL-1. O material apresentou efeito antibacteriano com valores de MIC e MB iguais a 0,5 e 0,5 ¿Êg mL-1. Com isso, o material na faixa de concentracao de 0,5-1 ¿Êg mL-1 apresenta efeito antibacteriano sem associacao com citotoxicida a celulas de eucariotas. Ainda, esse material e semissolido a temperatura ambiente o que contribue na viabilidade de aplicacoes clinicas, em particular, aplicacoes dermatologicas como no tratamento de feridas e queimaduras. No capitulo 4, avaliou-se a modificacao quimica da CS para que a mesma apresentasse grupos tiois na sua estrutura que serviriram como sitios de ancoragem para o NO. A sintese da CS tiolada (TCS) foi realizada pela conjugacao com o acido tioglicolico. Os grupos tiois foram identificados pela tecnica de XPS e o FTIR demonstrou a substituicao dos grupos aminas primarios por grupos amida secundarios. A formacao da S-nitroso-quitosana (S-nitroso-CS) foi confirmada por espectroscopia do Uv-vis e a liberacao do NO foi avaliada por um sistema de difusao vertical. A liberacao do NO foi sustentada por pelo menor 6 h em niveis adequados para aplicacao biomedica. A atividade antimicrobiana foi avaliada utilizando tres linhagens celulares a saber: Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Staphylococcus mutans. A S-nitroso-CS apresentou valores de MIC e MBC significativamente mais baixos do que a CS e a TCS. Nos ensaios de curva de morte demonstrou-se que apos 0,5 h de incubacao com as linhagens bacterianas, o tratamento de S-nitroso-CS causou a morte de 100% das mesmas nas tres linhagens celulares estudadas. A S-nitroso-CS mostrou-se um polimero capaz de liberar NO com potente acao antibacteriana. Por fim, no capitulo 5, avaliaram-se moleculas doadores de NO, GSNO, S-nitroso-MSA, S-nitroso-N-acetilcisteina (SNAC) e nitroprussiato de sodio (SNP), incorporadas nas CS NPs para aplicacao agricola. Observou-se que os materiais estudados aumentaram a produtividade da cana-de-acucar em estresse hidrico, com destaque para a GSNO-CS NPs e que esse mecanismo envolve a producao de RSNOs. Em conjunto, os resultados mostraram que ao incorporar doadores de NO em diferentes matrizes polimericas pode-se modular a liberacao de NO de acordo com a aplicacao desejada. Ainda, a escolha da matriz polimerica pode contribuir para alguma propriedade desejada como o carater semissolido desejado para aplicacoes dermatologicas estudado no capitulo 3 e a acao antibacteriana como a S-nitroso-CS estudada no capitulo 4. Com isso, os materiais estudados representam novas estrategias para a liberacao de NO controlada em aplicacoes biomedicas e agricolas.Nitric oxide (NO) is a small-size molecule, lipophilic and uncharged that has a myriad of biological applications, such as antitumor activity, antibacterial activity and vasodilation. The challenge of NO biological application is its relatively short half-life of 1-5 s. In order to overcome this challenge, the main purpose of this study is to incorporate NO donor molecules, in particular S-nitrosothiols (RSNO), into polymeric matrices to achieve a sustainable release of NO. This thesis is divided into five chapters that aim to evaluate different polymeric matrices. Three different polymer matrices were evaluated, chitosan nanoparticle, chitosan hydrogel and chemical modification of chitosan. All have in common the presence of chitosan (CS) and RSNOs, the differences between them are related to applications that each material proposes to carry out. In chapter 1, CS NPs containing S-nitroso-MSA were evaluated in order to achieve antitumor activity. Nanoparticles have demonstrated high performance in the treatment of different cancers. Then, these particles were coated with hyaluronic acid (HA), which has a high affinity for tumor cell membrane proteins. The materials were characterized using physical-chemical and morphological techniques and demonstrated a spherical shape, high stability in aqueous medium and antioxidant activity. The cytotoxicity tests were performed by MTT test using two tumor cell lines, the human prostatic carcinoma (PC3) and the human cervical carcinoma (HeLa). A cytotoxic effect of the nanoparticles with a dose-dependent profile was observed. Nanoparticles with the HA coating showed an increase in their cytotoxicity, compared to nanoparticle without the coating, which may represent a potential for a targeted treatment directed at tumor cells. In chapter 2, CS NPs containing S-nitrosoglutathione (GSNO) were used to evaluate their potential for targeted delivery of NO to human skin. When applying nanoparticles to epidermis of human skin samples ex vivo, it was observed a 32% increase in the concentration of S-nitrosothiols (RSNOs) in the skin. This result indicates that GSNO-CS NPs are able to release NO and it penetrates human skin causing an increase in RSNO dermal levels. It was evaluated that the effect of nanoparticles can be increased in combination with ultraviolet light phototherapy. In chapter 3, a hydrogel formulation that is successful in topical applications was evaluated. The hydrogel (CS-Hid) was synthesized using CS and Pluronic with GSNO. The presence of Pluronic F-127 gives the material a thermo-responsive behavior. Rheology and morphology analyze showed a hydrogel with a gelation temperature (Tgel) of 29.95 ± 0.85 ° C and good mechanical properties. GSNO spontaneously releases free NO, but shows rapid degradation. By incorporating GSNO into CS-Hid, NO release rates can be reduced, contributing to its release being sustained for longer periods of time. In addition, the GSNO diffusion test performed using a vertical diffusion cell showed that the GSNO diffusion is 60% less from CS-Hid than free GSNO. Cell viability tests were performed to evaluate the safety of the material using Vero cells and antibacterial action tests using Pseudomonas aeruginosa. The cytotoxicity assay with Vero cells demonstrated that the material has no cytotoxic effect at concentrations below 2.4 ìg mL-1. The material has an antibacterial effect with MIC and MB values xiii equal to 0.5 and 0.5 ìg mL-1. Thus, the material in the concentration range of 0.5-1 ìg mL-1 has an antibacterial effect without association with cytotoxicity to mammalian cells. Furthermore, this material is semi-solid at room temperature, which contributes to the viability of clinical applications, in particular, dermatological applications such as treatment of wounds and burns. In chapter 4, the chemical modification of CS was evaluated so that it had thiol groups in its structure that served as anchorage sites for NO. The synthesis of thiolated CS (TCS) was performed by conjugation with thioglycolic acid. The thiol groups were identified by the XPS technique; FTIR and NMR demonstrated the substitution of primary amine groups for amide secondary. The formation of S-nitroso-chitosan (S-nitroso-CS) was confirmed by UV-vis spectroscopy and the release of NO was evaluated by a vertical diffusion system. NO release was sustained for at least 6 h at levels suitable for biomedical application. Antimicrobial activity was evaluated using Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans. S-nitroso-CS showed MIC and MBC values significantly lower than CS and TCS. In the death curve assays it was demonstrated that after 0.5 h of incubation with the bacterial strains, the treatment of S-nitroso-CS caused the death of 100% of them in the three studied cell lines. S-nitroso-CS proved to be a polymer capable of releasing NO with a potent antibacterial action. Finally, in chapter 5, NO donors, GSNO, S-nitroso-MSA, S-nitroso-N-acetylcysteine (SNAC) and sodium nitroprusside (SNP), were incorporated into CS NPs for agricultural application. It was observed that those materials increased the productivity of sugar cane under water stress, with emphasis on GSNO-CS NPs, and that this mechanism involves the production of RSNOs. Together, the results showed that by incorporating NO donors in different polymeric matrices, it is possible to modulate the release of NO according to the desired application. The choice of the polymeric matrix can contribute to some desired property such as semi-solid character for dermatological applications studied in chapter 3 and the antibacterial action such as S-nitroso-CS studied in chapter 4. The studied materials represent new strategies for the release of controlled NO in biomedical and agricultural applications.Seabra, Amedea BarozziSilva, Emerson Rodrigo daMillazzotto, Marcella PecoraCunha, Rodrigo Luiz Oliveira RodriguesGalvão, Ana Carolina Santos de SouzaPelegrino, Milena Trevisan2020info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf200 f. : il.http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122002http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122002&midiaext=78959http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=122002&midiaext=78960Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.br/php/capa.php?obra=122002porreponame:Repositório Institucional da UFABCinstname:Universidade Federal do ABC (UFABC)instacron:UFABCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-03-18T16:20:44Zoai:BDTD:122002Repositório InstitucionalPUBhttp://www.biblioteca.ufabc.edu.br/oai/oai.phpopendoar:2022-03-18T16:20:44Repositório Institucional da UFABC - Universidade Federal do ABC (UFABC)false
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