Expressão recombinante da cisteíno protease nsP2 do arbovírus Mayaro em células de inseto

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Renata Torres da
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFABC
Texto Completo: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=102477
Resumo: Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança
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spelling Expressão recombinante da cisteíno protease nsP2 do arbovírus Mayaro em células de insetoEXPRESSÃO RECOMBINANTECÉLULA DE INSETOCISTEÍNO PROTEASERECOMBINANT EXPRESSIONINSECT CELLSCYSTEINE PROTEASEPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOSSISTEMAS - UFABCOrientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida SperançaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016.O arbovírus Mayaro (MAYV), encontrado nas regiões próximas a florestas e áreas rurais da América do Sul, é membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus. Este gênero é distribuído amplamente, tendo dois grupos principais: Alphavirus do Velho Mundo (Chikungunya, Sindbis, O¿nyong-nyong, Ross River, Semliki Forest) e do Novo Mundo (Encefalite Equina Venezuelana, Encefalite Equina Ocidental), de acordo com a região na qual foram isolados originalmente. O mosquito Haemagogus spp. é o principal vetor do MAYV que também já foi isolado de mosquitos do gênero Aedes spp. Considerando a semelhança do MAYV com o vírus Chikungunya, recentemente inserido no Brasil, e transmitido por Ae. aegypti, há risco de que o MAYV possa ser transmitido em áreas urbanas. Cabe ressaltar que no Brasil já foram registrados casos de co-circulação de MAYV durante surtos epidêmicos de dengue. A infecção por MAYV causa sintomas semelhantes a outras doenças febris, como a febre da dengue, a febre do Chikungunya, e a malária, dificultando o diagnóstico preciso dos casos. O genoma de MAYV, com cerca de 11,7 kb, é organizado em duas principais regiões: domínio não estrutural (extremidade 5¿ do RNA), contendo os genes que codificam as proteínas não estruturais (nsP1-4); e domínio estrutural, contendo os genes que codificam as proteínas estruturais. As proteínas não estruturais dos Alphavirus são necessárias para o processamento da poliproteína e para síntese do RNA viral. Dentre as proteínas não estruturais, as proteases virais podem ser imunogênicas além de se constituírem em excelentes alvos terapêuticos. O estudo comparativo do genoma dos Alphavirus indica que a proteína nsP2 de MAYV possui diversas atividades enzimáticas, incluindo a atividade de cisteíno protease em sua região C-terminal. Portanto, com o intuito de obter um método de diagnóstico sorológico específico para MAYV, utilizando sistema de expressão recombinante em células de insetos, foi realizada a construção de três baculovírus recombinantes para a nsP2 de MAYV, para obtenção da proteína completa (nsP2FL), do domínio de cisteíno protease da porção C-terminal (Pro38), e do domínio N-terminal (NT51) como controle negativo da atividade proteolítica. A expressão de cada uma das formas recombinantes da nsP2 foi realizada em célula de inseto High Five¿. Os resultados foram analisados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) e Western blotting. Apenas a construção NT51 da nsP2 de MAYV foi detectada na fração celular da cultura de High Five¿ por Western blotting. A análise de RNA das células High Five¿ e Sf-9 infectadas com os baculovírus recombinantes para nsP2FL e Pro38, revelou a presença de transcritos das proteínas recombinantes, indicando que a ausência dos produtos proteicos poderia ser devido a perda da cauda de histidina presente nas construções por atividade de proteólise na extremidade Cterminal. Esta hipótese foi confirmada após expressão das proteínas nsP2FL e Pro38, em célula High Five¿ infectada com baculovírus recombinantes para os genes que codificam as respectivas proteínas, com cauda de histidina na porção N-terminal.The arbovirus Mayaro (MAYV), found in regions close to forests and rural areas of South America, is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus. This genus is distributed widely, in two main groups, according to the region in which they were originally isolated: the Old World (Chikungunya, Sindbis, O'nyong-Nyong, Ross River, Semliki Forest) and the New World Alphavirus (Venezuelan Equine Encephalitis, Western Equine Encephalitis). The mosquito Haemagogus spp. is the main vector of MAYV which has also been isolated from mosquitoes of the genus Aedes spp. Considering the similarity of MAYV with Chikungunya virus, recently introduced in Brazil, and transmitted by Ae. aegypti, there is risk of MAYV urban transmission. Indeed, in Brazil, co-circulation of MAYV during dengue outbreaks have been related. Symptoms of MAYV fever are similar to other febrile diseases, such as dengue fever, Chikungunya fever, and malaria, making an accurate diagnosis, difficult. MAYV 11.7 kb genome is divided in two regions: non-structural domain (5'- RNA) containing the genes encoding the nonstructural proteins (nsP1-4); and structural domain containing genes encoding structural proteins. The Alphavirus nonstructural proteins are required for processing of the polyprotein and for viral RNA synthesis. Among the non-structural proteins, viral proteases may be immunogenic besides being excellent therapeutic targets. Genome comparative studies of Alphavirus indicates that the MAYV nsP2 protein has diverse enzymatic activities including a cysteine protease activity in its C-terminal region. Thus, with the objective to obtain a specific diagnostic method for MAYV, using a recombinant expression system in insect cells, a construction of three MAYV nsP2 recombinant baculoviruses to obtain the complete protein (nsP2FL), the C-terminal cysteine protease domain (Pro38), and the N-terminal (NT51) domain as a proteolysis activity negative control. The expression of each nsP2 construction was performed on Sf-9 and High Five¿ insect cells and the results were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE) and Western blotting. Only the nsP2 NT51 construction was detected in the cellular fraction of Sf-9 and High Five¿ cultures by Western blotting. RNA analysis of Sf-9 cells infected with nsP2FL and Pro38 recombinant baculoviruses revealed the presence of transcripts, suggesting that the absence of the corresponding protein products occurred due the proteolysis of the C-terminal portion of the protein, resulting in histidine tail elimination. This hypothesis was confirmed by expression of nsP2FL e Pro38, proteins in Sf-9 and High Five¿ cells infected with recombinant baculoviruses for the genes encoding the respective proteins with histidine tail at the N-terminal portion.Sperança, Márcia AparecidaCosta, Renata Torres da2016info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf120 f. : il.http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=102477http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=102477&midiaext=72681http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=102477&midiaext=72680Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.br/php/capa.php?obra=102477porreponame:Repositório Institucional da UFABCinstname:Universidade Federal do ABC (UFABC)instacron:UFABCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-03-18T16:08:54Zoai:BDTD:102477Repositório InstitucionalPUBhttp://www.biblioteca.ufabc.edu.br/oai/oai.phpopendoar:2022-03-18T16:08:54Repositório Institucional da UFABC - Universidade Federal do ABC (UFABC)false
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