Caracterização in vitro de diferentes linhagens genéticas do vírus da raiva isoladas de morcegos não hematófagos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Garcia, Jaíne Gonçalves
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFABC
Texto Completo: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=121937
Resumo: Orientadora: Profa. Dra. Helena Beatriz de Carvalho Ruthner Batista
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spelling Caracterização in vitro de diferentes linhagens genéticas do vírus da raiva isoladas de morcegos não hematófagosRAIVAMORCEGO NÃO HEMATÓFAGOCARACTERIZAÇÃO IN VITRORABIESNON HEMATOPHAGOUS BATSIN VITRO CHARACTERIZATIONPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOSSISTEMAS - UFABCOrientadora: Profa. Dra. Helena Beatriz de Carvalho Ruthner BatistaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, Santo André, 2020.A raiva é uma das mais antigas doenças que se tem registro causada pelo vírus da raiva (RABV), essa zoonose tem distribuição mundial e ainda causa a morte de aproximadamente 60.000 pessoas por ano no mundo. O RABV é um vírus com genoma de RNA pertencente à família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus. Apesar dos avanços nas pesquisas sobre este vírus, ainda existem lacunas a serem preenchidas, principalmente sobre a biologia do RABV e seus mecanismos de adaptação aos hospedeiros. Nos últimos anos, a detecção do RABV em diferentes espécies de morcegos tem sido destaque na Saúde Pública. A possibilidade desses animais desenvolverem hábitos sinantrópicos, considerando que são reservatórios para o RABV, pode causar maior risco de infecções humanas. Este trabalho teve como objetivo elucidar aspectos sobre a adaptação e manutenção do RABV em diferentes espécies de morcegos não hematófagos por meio de ensaios de cinética para replicação in vitro. Foram selecionadas 9 amostras de RABV isoladas de diferentes espécies de morcegos não hematófagos. Inicialmente tais amostras de RABV foram submetidas à caracterização genética, através da extração de RNA, transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tendo como alvo a nucleoproteína, sequenciamento genético e análise filogenética. As espécies de morcegos foram identificadas geneticamente através da extração de DNA, PCR tendo como alvo o citocromo oxidase I (COI) do DNA mitocondrial (DNAmt) e posterior sequenciamento e análise filogenética. Após seleção e caracterização, as amostras foram submetidas à inoculação intracerebral em camundongos albinos suíços e posteriormente adaptadas ao crescimento in vitro em células de rim embrionário humano (HEK 293T). Cada passagem em série nas células foi submetida ao teste de Imunofluorescência Direta (IFD). Foram identificadas as seguintes linhagens genéticas do RABV: linhagem genética de morcego frugívoro Artibeus lituratus (3 amostras), linhagem genética de morcego insetívoro Eptesicus furinalis (3 amostras) e linhagem genética de morcego insetívoro Tadarida brasiliensis (3 amostras). Com a identificação genética das espécies, foi possível identificar que cada linhagem genética de RABV foi mantida pela respectiva espécie de morcego. Foram realizadas 10 passagens sucessivas das amostras descritas em células HEK 293T, 6 amostras puderam ser adaptadas ao cultivo celular e somente 3 amostras não adaptaram sendo 1 de linhagem genética de morcego insetívoro Eptesicus furinalis (IP1282/16) e 2 de linhagem genética de morcego insetívoro Tadarida brasiliensis (PG980/17 e PG981/17). Para os ensaios de cinéticas foram realizados testes de penetração viral e curva de crescimento viral com as amostras adaptadas em linhagem HEK 293. Os resultados das amostras analisadas demonstram que não houve casos de spillover interespécies para transmissão do RABV. E os resultados dos ensaios de cinética de replicação viral apresentaram diferenças significativas das amostras na fase de penetração viral. No entanto, as amostras não obtiveram diferenças significativas na fase de crescimento viral e propagação nas células. Com os conhecimentos adquiridos de cada linhagem genética de RABV neste estudo, é possível propor melhorias no diagnóstico da raiva como também na vigilância para controlar a doença especificamente nessas espécies.Rabies is one of the oldest recorded diseases caused by the rabies virus (RABV), this zoonosis has a worldwide distribution and still causes the death of approximately 60,000 people per year around the world. RABV is a virus with an RNA genome belonging to the family Rhabdoviridae, genus Lyssavirus. Despite advances in research on this virus, there are still gaps to be filled, mainly on the biology of RABV and its mechanisms of adaptation to hosts. In recent years, the detection of RABV in different bat species has been highlighted in Public Health. The possibility of these animals to develop synanthropic habits, considering that they are reservoirs for RABV, may cause a greater risk of human infections. This work aimed to elucidate aspects about the adaptation and maintenance of RABV in different species of non hematophagous bats through kinetic assays for in vitro replication. 9 RABV samples isolated from different species of non hematophagous bats were selected. Initially, such RABV samples were subjected to genetic characterization, through RNA extraction, reverse transcription followed by the polymerase chain reaction (RT-PCR) targeting nucleoprotein, genetic sequencing and phylogenetic analysis. Bat species were genetically identified through DNA extraction, PCR targeting cytochrome oxidase I (COI) from mitochondrial DNA (DNAmt) and subsequent sequencing and phylogenetic analysis. After selection and characterization, the samples were subjected to intracerebral inoculation in Swiss albino mice and later adapted to in vitro growth in human embryonic kidney cells (HEK 293T). Each serial passage in the cells was subjected to the Direct Immunofluorescence Antibody test (DFAT). The following RABV genetic lineages were identified: genetic lineage of frugivorous bat Artibeus lituratus (3 samples), genetic lineage of insectivorous bat Eptesicus furinalis (3 samples) and genetic lineage of insectivorous bat Tadarida brasiliensis (3 samples). With the genetic identification of the species, it was possible to identify that each genetic lineage of RABV was maintained by the respective species of bat. Ten successive passages of the samples described in HEK 293T cells were performed, 6 samples could be adapted to the cell culture and only 3 samples did not, 1 from genetic line of insectivorous bat Eptesicus furinalis (IP1282/16) and 2 from genetic lineage of insectivorous bat Tadarida brasiliensis (PG980/17 and PG981/17). For the kinetics tests, viral penetration tests and viral growth curves were performed with samples adapted in HEK 293 cell line. The results of the analyzed samples demonstrate that there were no cases of interspecies spillover for transmission of RABV. And the results of the viral replication kinetics tests showed significant differences from the samples in the viral penetration phase. However, the samples did not obtain significant differences in the phase of viral growth and propagation in the cells. With the knowledge acquired from each RABV genetic strain in this study, it is possible to propose improvements in the diagnosis of rabies as well as in surveillance to control the disease specifically in these species.Batista, Helena Beatriz de Carvalho RuthnerFerreira, Karin Côrrea SchefferSasaki, Sergio DaishiGarcia, Jaíne Gonçalves2020info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf64 f. : il.http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=121937http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=121937&midiaext=78838http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=121937&midiaext=78837Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.br/php/capa.php?obra=121937porreponame:Repositório Institucional da UFABCinstname:Universidade Federal do ABC (UFABC)instacron:UFABCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-10-18T16:04:47Zoai:BDTD:121937Repositório InstitucionalPUBhttp://www.biblioteca.ufabc.edu.br/oai/oai.phpopendoar:2021-10-18T16:04:47Repositório Institucional da UFABC - Universidade Federal do ABC (UFABC)false
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