Estudo sobre a atividade antimicrobiana de substâncias extraídas e purificadas de secreções da pele de anfíbios

• Autor(a) principal: Freitas, Carlos Iberê Alves
• Data de Publicação: 2003
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC)
• Texto Completo: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/2681
• topic: Antiinfecciosos; Antibacterianos; Venenos de Anfíbios

A emergência de mocroorganismos resistente a multidrogas, tais como Staphylococcus aureus as resistentes a meticilina, Enterococcus resistente a vancomicina, e Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas, tem incitado esforçospara desenvolver e pesquisar novas classes de antibióticos que possam ter utilidade clínica. Nos últimos anos, uma variedade de antibióticos de baixo peso molecular têm sido isolados de diversas espécies animais. Estes agentes incluem peptídeos, lipídios, e alcalóides, exibem atividade antibiótica contra micróbios do meio ambiente e considera-se que desempenhem um papel na imunidade inata. Compostos com largo espectro de atividade antimicrobiana que são sintetizados pelas glândulas granulares presentes na pele de anuras (rãs e sapos) têm recebido uma crescente atenção como agentes terapêuticos em potencial. Nós relatamos aqui a descoberta de um antibiótico esteroidal de atividade de largo espectro, bufadienolídeos, chamados hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin e bufalin de Bufo schneideri, um sapo Brasileiro, com atividade inibitória diferenciada contra sete microorganismos e nenhuma atividade contra Pseudomonas aeruginosa. A secreção da pele do sapo foi obtida porcompressão manual das glândulas paracnemis e tibial. Tr~e peptídeos com estruta possivelmente relacionada com uma potente atividade inibitória para bactéria gram positiva, Staphylococcus aureus e uma potente proteína com forte atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 microg/ml) foi isolada com secreções da pele de Leptodactylus pentadactylus estimuladas por adrenalina obtidas por injeção subcutânea de 500 micro l (100 microg/ml) e caracterizada. Os bufadienolídeos foram obtidos com separação em CLAE de fase reversa sendo executado utilizando-se uma coluna C-18 (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) com um gradiente de 0-40 % de acetonitrila/água e 0,05 % de ácido trifluoroacético. Análise de NMR de alta resolução das amostras purificadas por aplicação de seqüência de pulsos modernos tais como 1H, 1H-COSY e NOESY, e determinação da correlação heteronuclear dos carbono-hidrogênio ligados diretamente 1H, 13C-COSY (HETCOR) e via detecção do hidrogênio inversa (HMQC), bem como o seqüenciamento a longa distância, COLOC e HMBC, permitindo assim sua identificação como um esteróide do tipo bufodienolídeo. A proteína de L. pentadactylus foi purificada por cromatografia em Sephacryl S-400 (460 mm x 6 mm) eluída com um tampão (Tris – HCl 0,05 N) e sua pureza foi avaliada poreletroforese em condições desnayurantes e não desnaturantes.A proteína total foi determinada pelo método de Bradford usando albumina soro bovina como padrão. O isolamento dos peptídeos foi efetuado usando-se o exsudato liofilizado e redissolvendo em água bidestilada/TFA 0,05 % (20:1; P:V) e corrido numa coluna C18 de fase reversa em CLAE (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluída com um gradiente linear de 5 - 80% em 103 min num fluxo de 5 ml/min com acetonitrila/água e ácido trifluoroacético 0.05 %. A atividade antimicrobiana de todas as amostras foi monitorada pelos métodos de Bauer – Kirby e placa de microdiluição padrãousando Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P e Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. No primeiro método, cada placa com agar Müeller –Hinton após promover incubação por 24 h a 35 °C. As zonas claras na superfície do agar foram tomadas como indicativoda atividade antibacteriana. O diâmetro destas foram mensuradas e a atividade foi expressa em área das zonas claras (mm2). As incubações com os microorganismos foram feitas em caldo de B.H.I. por diferentes tempos até 24 h a 35°C e estimada a influência da desnaturação na atividade das amostras protéicas. Após incubação, na absorbância de 492 nm cada poço foi determinado usando-se um Detector Shimadzu UV – VS modelo SPD - 10A VP. A mínima concentração inibitória (MICs) se possível foi determinada pelo método da microdiluição padrão. Todos os procedimentos foram executados de acordo com os manuais de instrução do Comitê National de Padronização para Laboratórios Clínicos (Wayne, PA, USA). A hemólise induzida por amostras foi determinada por incubação de uma suspensão 5% (v/v) de hemácias humanas dos tipos antigênicos A e O, rato e caprinos em tampão fosfato - salina com quantidades apropriadas das amostras a 37 ºC até 24 h. O sobrenadante foi mensurado em densidade optical a 541 nm. Esta foi comparada a uma suspensão tratada com detergente a 0,1 % com agitação enérgica e definido o % de hemólise. Todos os compostos manifestaram moderado ou nenhuma atividade hemolítica. A proteína de L. pentadactylus apresentou uma concentração hemolítica mínima de 2,09 x 10-4, 1,34x10-2, 1,07x10-1 e 1,34x10-2 microgramas para rato, caprino, tipos antigênicos humanos A e O humanos respectivamente. Sob refrigeração estes valores decrescem. Para analisar interrelação entre a assimetria e mecanismos, estimativa de parâmetros cinéticos foram obtidos pelos modelos matemáticos de equações de Gompertz e regressão não linear, ANOVA e teste de comparação múltipla de Tukey.