Papel da proteina G sensível a toxina Pertussis na migração de neutrófilos e eosinófilos e na dor inflamatória

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Brito, Gerly Anne de Castro
Data de Publicação: 1997
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC)
Texto Completo: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/70424
Resumo: Este documento está disponível online com base na Portaria Nº 348, de 08 de dezembro de 2022, Disponível em: http://biblioteca.ufc.br/wp-content/uploads/2022/12/portaria348-2022.pdf que autoriza a digitalização e a disponibilização no Repositório Institucional (RI) da coleção retrospectiva de TCC, dissertações e teses da UFC, sem o termo de anuência prévia dos autores. Em caso de trabalhos com pedidos de patente e/ou de embargo, cabe, exclusivamente, ao autor(a) solicitar a restrição de acesso ou retirada de seu trabalho do RI, mediante apresentação de documento comprobatório à Direção do Sistema de Bibliotecas.
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spelling Papel da proteina G sensível a toxina Pertussis na migração de neutrófilos e eosinófilos e na dor inflamatóriaDorInflamaçãoToxina PertussisEste documento está disponível online com base na Portaria Nº 348, de 08 de dezembro de 2022, Disponível em: http://biblioteca.ufc.br/wp-content/uploads/2022/12/portaria348-2022.pdf que autoriza a digitalização e a disponibilização no Repositório Institucional (RI) da coleção retrospectiva de TCC, dissertações e teses da UFC, sem o termo de anuência prévia dos autores. Em caso de trabalhos com pedidos de patente e/ou de embargo, cabe, exclusivamente, ao autor(a) solicitar a restrição de acesso ou retirada de seu trabalho do RI, mediante apresentação de documento comprobatório à Direção do Sistema de Bibliotecas.Pertussis toxm (PT) is composed of two subunits, namely A protomer and B oligomer. The A protomer (Sl) has ADP-ribosyltransferase activity on G protein. The B oligomer (S2:S3:2S4:S5) contnbutes to the adhesion of the toxin to target cells. We have demonstrated using a PT analog (PTm; 165-9K/129G), with no ADP-ribosyltransferase activity, that the effects of PT on neutrophil imgration in vivo was dependent on enzymatic activity of the A protomer. In the first part of this work, histopathological analysis of rat mesentery was used to quantify the effect of two anti-inflammatory agents (PT and dexamethasone; Dex) on leukocyte migration. The intravenous (iv) mjection of PT and Dex, but not PTm, 1 h prior to the íntraperitoneal (ip) injection of the inflammatory stimuli (LPS or fMLP), reduced (p<0,05) the neutrophil diapedesis and mfiltration induced by the later two agents in the rat mesentery. This inhibitory effect of Dex and PT was clearly visible in the fíelds nearest the venule (up to 200 pm), demonstrating that these anti- mflammatory agents act preferentially in neutrophil transmigration from the vascular lumen mto the interstitial space, but not in cell movement in response to a haptotatic gradient. The number of neutrophils/field in mesentery of animais treated with PTm was sigmfícantly lower m farthest fíelds ffom the venules, suggesting an effect of this toxin on the haptotaxis. The mesentery of rats treated with Dex showed a decreased number of neutrophils within the venules, suggesting that this inhibitor may be acting at a step that precedes neutrophil transmigration to the inflamed tissue (margination, rolling and adhesion). In contrast to what was observed with Dex treatment, the number of neutrophils found in mesenteric venules was signifícantly higher in animais treated with PT. This discrepancy shows that PT and Dex act via different mechanisms and suggests that PT A protomer prevents looomotion of neutrophils from the vascular lumen to the interstitial space. In conclusion, the method described here is usefi.il for quantifying the anti-inflammatory effect of several substances. The advantage of this histophatological approach is that it permits the gathering of additional information about the steps involved in leukocyte migration. Such information may contribute to our understanding of mechanisms underling the action of different anti-inflammatory substances. In addition, it was demonstrated that, different ffom PTm, iv injection of PT signifícantly inhibits eosinopliil migration and mesentery infiltration induced by sephadex and leukotriene B4. This data suggest that the eosinophil migration is mediated by a G protein sensible to PT A protomer. The in vítro studies demonstrated that the preincubation of human neutrophils with PT inhibit (p<0,05) the fMLP induced neutrophil chemotaxis. This data suggests that the PT anti-inflainmatory effect in vivo, is dependent on its direct activity on neutrophils, instead of a systemic action. PTm also did not inhibit the fMLP induced neutrophil chemotaxis in vítro. This data is in accordance with the in vivo results, showing that this inhibitory effect of PT is dependent on the A protomer enzymatic activity. Besides this, ít was shown that cc-galactose, D-frutose or a-methyl- mannoside, did not block the PT inhibitory effect on neutrophil chemotaxis, in vítro, suggesting an extra neutrophil binding site on the toxin. PT and PTm in vítro, induced neutrophil chemotaxis, mdicating a toxin direct stimulatory effect on neutrophil, wliich seems not be related to the enzymatic activity of PT A protomer. As the PT and PTm chemotatic effect was blocked by carbohydrates, its likely that this action depends on the B ohgomer lectin domains. This domains are similar to endothelial selectms, and like them, can bmd to carbohydrates. Then its possible to speculate, that the interaction of selectin-carbohydrate m vivo, besides its participation on the neutrophil rolling, has a direct activating role on these cells migration. In the second part of this work, it was shown that the ip admmistration of PT, but not PTm, reduced (p<0,05) the number of zymosan and acetic acid induced writhmgs in Swiss rnice, demonstrating that this toxm analgesic activity is also dependent on the enzymatic action of the A protomer. In this model, other agents that increase the cAMP intracellular levei, such as cólera toxin, forskolin, aminofilin and Db-cAMP, also showed antinociceptive effect. However, after depletion of resident cells by pentoneal cavity washing, Db-cAMP did not show analgesic activity. Contrary, Db-cAMP partially restore the acetic acid nociceptive effect, that had been practically abolished by pentoneal wash. These results suggest that m this model, the PT antinociceptive effect could occur as a consequence of increase in cytosolic cAMP concentations in resident cells. In the hyperalgesia model, it was shown that the intraplantar (ipl) admimstration of PT and PTm, 30 minutes before ipl injection of PGE2 and dopamine reduced (p<0,05) the intensity of hyperalgesia induced by these agents in Wistar rat paw, suggesting that this effect is not related to PT A protomer activity. The PTm, but not PT, analgesic action seems to be related to a PT lectin domain with D-frutose affímty, as this sugar partially blocked the PTm effect on PGE2 induced hyperalgesia. The PT pretreatment, did not blocked the Db-cAMP induced hyperalgesia. Besides this, PT treatment 2 hours after PGE2 and Db-cAMP did not reduced its hyperalgesic effect. These data suggest that PT may act by preventing the nociceptor sensibilization, not being effective in ongoing hyperalgesia. It was also noticed that PT analgesic effect was inhibited by a NO sintase false substract (NO-Arg), but not by the guanilato-ciclase inhibitor (ODQ). In view of this results, it is possible to speculate two mechanisms for the PT analgesic effect in the hyperalgesia model: 1) A blockage of the cAMP production by the nervous terminal; 2) An induction of nitric oxide production, which probably act by a different pathway from that of guanilato-ciclase activation. In conclusion, this work originally demonstrate an analgesic effect of PT, but additional studies are necessary to elucidate the exact mechanism for the PT inhibitory effect on the hyperalgesia model.A toxina pertussis (TP) é constituída de um protômero A (Sl) e um oligômero B (S2:S3:2S4:S5). O protômero A é responsável pela ADP- nbosilação de uma proteína G, levando a sua mativação. O oligômero B liga a toxina a célula alvo. O uso de uma toxina pertussis mutante (TPm; 165- 9K/129G), cuja Sl encontra-se inativa, nos permitiu demonstrar anteriormente, que os efeitos mibitórios de TP sobre migração de neutrófilos in vivo, devem-se prmcipalmente à atividade enzimática do protômero A desta toxma. Na primeira parte desse trabalho, padronizou-se um método histopatológico para a quantificação dos efeitos de substâncias antimflamatórias. Através desta abordagem, verificou-se que a injeção endovenosa (e.v.) de dexametasona (Dex) e TP, mas não de TPm, 1 h antes da administração intraperitoneal (i.p.) dos estímulos inflamatórios LPS ou fMLP, reduziu (p<0,05) a infiltração neutrofílica e o número de neutrófilos em diapedese. TP reteve os neutrófilos no lúmen de vênulas mesentéricas. Estes dados possibilitaram a conclusão de que a TP, através da atividade enzimática de seu protômero A, inibe a migração de neutrófilos, bloqueando o movimento celular que pennite a saída da célula do meio intra para o extracelular. Ao contrário do observado nos animais pré-tratados com TP, a contagem do número de neutrófilos no lúmen de vênulas mesentéricas de anúnais tratados com Dex, foi significativamente menor que no mesentério dos animais controles. De posse desses dados, conclui-se que a Dex tem um efeito diferente da TP sobre migração de neutrófilos, interferindo em etapas que antecedem o movimento de saída desta célula do meio intravascular, possivelmente mibindo a marginação, o rolamento e a adesão dos leucócitos ao endotélio. Observou-se ainda através deste modelo, que a contagem do número de neutrófilos por campo no mesentério dos animais pré-tratados com TPm, diminuiu (p<0,05) a medida que se distancia da vênula, sugerindo que TPm, mas não TP ou Dex, parece interferir na haptotaxia de neutrófilos através do tecido inflamado. Conclui-se então, que o método histopatológico padronizado neste trabalho, é simples e de baixo custo, apresentando a vantagem de permitir a obtenção de informações adicionais sobre os passos da migração de leucócitos nos quais as substâncias antimflamatórias estão atuando, levando ao melhor esclarecimento de seu mecanismo de ação. Os dados apresentados aqui, mostram também que a administração e.v. TP, ao contrário de TPm, 1 h antes da injeção i.p. de sephadex ou leucotrieno B4, inibiu de forma significativa (p<0,05) a migração de eosinófílos para a cavidade peritoneal e a infiltração eosinofílica de mesenténo de ratos induzida por estes agentes. Portanto, sugere-se que a migração de eosinófílos induzida por sephadex ou leucotrieno B4 é mediada por um proteína G sensível ao protômero A de TP. Os dados obtidos zú vitro neste trabalho, mostraram que a pré- íncubação de neutrófilos humanos com TP inibiu (p<0,05) a quimiotaxia dessas células induzida por fMLP, o que sugere que o efeito antiinflamatório de TP in vivo, resulta provavelmente, de uma atividade direta sobre neutrófilos e não de uma ação sistêmica. TPm também não inibiu a quimiotaxia de neutrófilos mduzida por fMLP in vitro, sugerindo que este efeito de TP in vitro, é dependente da atividade ADP-ribosiladora do protômero A. Além disso, mostrou-se que os açúcares (a-D-galactose, D- frutose e oc-D-metil-manosídeo) não bloquearam o efeito inibidor da TP na quimiotaxia de neutrófilos in vitro, sugerindo a existência de outro sítio de ligação desta toxina ao neutrófílo. TP e TPm induziram quimiotaxia de neutrófilos in vitro, indicando uma atividade estimulatória direta dessas toxinas em neutrófilos que parece não depender da atividade enzimática do protômero A de TP. Como a quimiotaxia induzida por TP e TPm foi bloqueada pelos açúcares, este efeito parece depender de uma porção lectínica do oligômero B, que se assemelha a selectinas do endotélio e como estas, também são capazes de se ligar a carboidratos. Este dado permite a suposição de que a interação entre selectina-carboidrato in vivo, além de participar no rolamento do neutrófílo, possui um papel estimulador direto sobre a migração destas células. Na segunda parte deste trabalho, demonstrou-se que a administração i.p. de TP, mas não de TPm, reduziu (p<0,05) o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético e zymosan em camundongos, demonstrando que a atividade analgésica desta toxina é dependente da atividade enzimática do protômero A. Outros agentes que induzem aumento dos níveis intracelulares de AMPc como toxma da cólera, forskolin, aminofilina e dibutiril-AMPc apresentaram também efeito antinociceptivo neste modelo. Porém após a lavagem da cavidade peritoneal para a retirada de células residentes, o Db-AMPc não mais apresentou atividade analgésica, pelo contrário, restabeleceu, embora parcialmente, a resposta nociceptiva ao ácido acético que havia sido praticamente abolida pela depleção das células residentes. Estes dados levantam a possibilidade de que neste modelo, a atividade antinociceptiva de TP ocorre em virtude de um aumento do AMPc ao nível de células residentes. No modelo de hiperalgesia em pata de ratos Wistar, a administração mtraplantar (ipl.) de TP e TPm 30 minutos antes da injeção (ipl.) de PGE2 e dopamina, reduziram (p<0,05) a intensidade da resposta hiperalgésica induzida por estes agentes, sugerindo que este efeito independe da atividade enzimática do protômero A de TP. O efeito analgésico de TPm, mas não de TP, parece depender em parte de uma porção lectímca com afinidade pela D-frutose, uma vez que este açúcar bloqueou parcialmente o efeito de TPm na hiperalgesia induzida por PGE2. O pré-tratamento com TP não teve efeito analgésico na hiperalgesia induzida por Db-AMPc. Ademais, a administração de TP 2 h após a PGE2 e Db-AMPc não teve efeito na hiperalgesia induzida por este agente. Os dados sugerem que a TP age inibindo a sensibilização do nociceptor, não se mostrando eficaz na hiperalgesia já instalada. Verificou-se ainda que o efeito analgésico de TP foi inibido por NO-Arg (um falso substrato para a NO sintase), porém não foi inibido por um inibidor da guanilato ciclase (ODQ). Portanto, os dados obtidos aqui, permitem especular dois possíveis mecanismos para explicar a atividade analgésica de TP no modelo de hiperalgesia: 1. Bloqueio da produção de AMPc no terminal nervoso; 2. Produção de óxido nítrico, que por sua vez deve agir por uma via independente da ativação da guanilato- ciclase. Este trabalho mostra de forma inédita um efeito analgésico da TP, no entanto, mais estudos serão necessários para elucidar precisamente o mecanismo desse efeito no modelo de hiperalgesia.Ribeiro, Ronaldo de AlbuquerqueBrito, Gerly Anne de Castro2023-02-02T14:50:41Z2023-02-02T14:50:41Z1997info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfBRITO, Gerly Anne de Castro. Papel da proteina G sensível a toxina Pertussis na migração de neutrófilos e eosinófilos e na dor inflamatória. Fortaleza, 1997. 170 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 1997. Disponível em: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/70424. Acesso em: 02 fev. 2023.http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/70424porreponame:Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC)instname:Universidade Federal do Ceará (UFC)instacron:UFCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2023-02-02T14:51:33Zoai:repositorio.ufc.br:riufc/70424Repositório InstitucionalPUBhttp://www.repositorio.ufc.br/ri-oai/requestbu@ufc.br || repositorio@ufc.bropendoar:2023-02-02T14:51:33Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC) - Universidade Federal do Ceará (UFC)false
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