Estudo sobre a atividade antimicrobiana de substÃncias extraÃdas e purificadas de secreÃÃes da pele de anfÃbios

• Autor(a) principal: Carlos Iberà Alves Freitas
• Data de Publicação: 2003
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=240
• topic: Antimicrobianos; AnfÃbios; PurificaÃÃo; Metabolismo bacteriano; Antimicrobial; Amphibians; Purification; Bacterial metabolism; FARMACOLOGIA

A emergÃncia de mocroorganismos resistente a multidrogas, tais como Staphylococcus aureus as resistentes a meticilina, Enterococcus resistente a vancomicina, e Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas, tem incitado esforÃospara desenvolver e pesquisar novas classes de antibiÃticos que possam ter utilidade clÃnica. Nos Ãltimos anos, uma variedade de antibiÃticos de baixo peso molecular tÃm sido isolados de diversas espÃcies animais. Estes agentes incluem peptÃdeos, lipÃdios, e alcalÃides, exibem atividade antibiÃtica contra micrÃbios do meio ambiente e considera-se que desempenhem um papel na imunidade inata. Compostos com largo espectro de atividade antimicrobiana que sÃo sintetizados pelas glÃndulas granulares presentes na pele de anuras (rÃs e sapos) tÃm recebido uma crescente atenÃÃo como agentes terapÃuticos em potencial. NÃs relatamos aqui a descoberta de um antibiÃtico esteroidal de atividade de largo espectro, bufadienolÃdeos, chamados hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin e bufalin de Bufo schneideri, um sapo Brasileiro, com atividade inibitÃria diferenciada contra sete microorganismos e nenhuma atividade contra Pseudomonas aeruginosa. A secreÃÃo da pele do sapo foi obtida porcompressÃo manual das glÃndulas paracnemis e tibial. Tr~e peptÃdeos com estruta possivelmente relacionada com uma potente atividade inibitÃria para bactÃria gram positiva, Staphylococcus aureus e uma potente proteÃna com forte atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 microg/ml) foi isolada com secreÃÃes da pele de Leptodactylus pentadactylus estimuladas por adrenalina obtidas por injeÃÃo subcutÃnea de 500 micro l (100 microg/ml) e caracterizada. Os bufadienolÃdeos foram obtidos com separaÃÃo em CLAE de fase reversa sendo executado utilizando-se uma coluna C-18 (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) com um gradiente de 0-40 % de acetonitrila/Ãgua e 0,05 % de Ãcido trifluoroacÃtico. AnÃlise de NMR de alta resoluÃÃo das amostras purificadas por aplicaÃÃo de seqÃÃncia de pulsos modernos tais como 1H, 1H-COSY e NOESY, e determinaÃÃo da correlaÃÃo heteronuclear dos carbono-hidrogÃnio ligados diretamente 1H, 13C-COSY (HETCOR) e via detecÃÃo do hidrogÃnio inversa (HMQC), bem como o seqÃenciamento a longa distÃncia, COLOC e HMBC, permitindo assim sua identificaÃÃo como um esterÃide do tipo bufodienolÃdeo. A proteÃna de L. pentadactylus foi purificada por cromatografia em Sephacryl S-400 (460 mm x 6 mm) eluÃda com um tampÃo (Tris â HCl 0,05 N) e sua pureza foi avaliada poreletroforese em condiÃÃes desnayurantes e nÃo desnaturantes.A proteÃna total foi determinada pelo mÃtodo de Bradford usando albumina soro bovina como padrÃo. O isolamento dos peptÃdeos foi efetuado usando-se o exsudato liofilizado e redissolvendo em Ãgua bidestilada/TFA 0,05 % (20:1; P:V) e corrido numa coluna C18 de fase reversa em CLAE (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluÃda com um gradiente linear de 5 - 80% em 103 min num fluxo de 5 ml/min com acetonitrila/Ãgua e Ãcido trifluoroacÃtico 0.05 %. A atividade antimicrobiana de todas as amostras foi monitorada pelos mÃtodos de Bauer â Kirby e placa de microdiluiÃÃo padrÃousando Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P e Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. No primeiro mÃtodo, cada placa com agar MÃeller âHinton apÃs promover incubaÃÃo por 24 h a 35 ÂC. As zonas claras na superfÃcie do agar foram tomadas como indicativoda atividade antibacteriana. O diÃmetro destas foram mensuradas e a atividade foi expressa em Ãrea das zonas claras (mm2). As incubaÃÃes com os microorganismos foram feitas em caldo de B.H.I. por diferentes tempos atà 24 h a 35ÂC e estimada a influÃncia da desnaturaÃÃo na atividade das amostras protÃicas. ApÃs incubaÃÃo, na absorbÃncia de 492 nm cada poÃo foi determinado usando-se um Detector Shimadzu UV â VS modelo SPD - 10A VP. A mÃnima concentraÃÃo inibitÃria (MICs) se possÃvel foi determinada pelo mÃtodo da microdiluiÃÃo padrÃo. Todos os procedimentos foram executados de acordo com os manuais de instruÃÃo do Comità National de PadronizaÃÃo para LaboratÃrios ClÃnicos (Wayne, PA, USA). A hemÃlise induzida por amostras foi determinada por incubaÃÃo de uma suspensÃo 5% (v/v) de hemÃcias humanas dos tipos antigÃnicos A e O, rato e caprinos em tampÃo fosfato - salina com quantidades apropriadas das amostras a 37 ÂC atà 24 h. O sobrenadante foi mensurado em densidade optical a 541 nm. Esta foi comparada a uma suspensÃo tratada com detergente a 0,1 % com agitaÃÃo enÃrgica e definido o % de hemÃlise. Todos os compostos manifestaram moderado ou nenhuma atividade hemolÃtica. A proteÃna de L. pentadactylus apresentou uma concentraÃÃo hemolÃtica mÃnima de 2,09 x 10-4, 1,34x10-2, 1,07x10-1 e 1,34x10-2 microgramas para rato, caprino, tipos antigÃnicos humanos A e O humanos respectivamente. Sob refrigeraÃÃo estes valores decrescem. Para analisar interrelaÃÃo entre a assimetria e mecanismos, estimativa de parÃmetros cinÃticos foram obtidos pelos modelos matemÃticos de equaÃÃes de Gompertz e regressÃo nÃo linear, ANOVA e teste de comparaÃÃo mÃltipla de Tukey