TransformaÃÃo genÃtica de feijÃo-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I

• Autor(a) principal: Emmanuel de Sousa Jereissati
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=8332
• topic: quitina; silenciamento gÃnico; apoplasto; chitin; gene silencing; apoplast; BIOLOGIA MOLECULAR

A expressÃo heterÃloga de genes que codificam proteÃnas relacionadas à patogÃnse (PR-proteÃnas) representa uma alternativa promissora para o desenvolvimento de plantas resistentes ao ataque de fungos. Dentre as PR-proteÃnas com grande potencial biotecnolÃgico, estÃo as quitinases, hidrolases que catalisam a degradaÃÃo da quitina, que à um polÃmero constituinte da parede celular de muitas espÃcies de fungos fitopatogÃnicos. AlÃm da funÃÃo relacionada aos mecanismos de defesa, acredita-se que essas enzimas podem desempenhar outros papÃis, como a regulaÃÃo de processos de crescimento e desenvolvimento em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de uma quitinase de classe I de feijÃo-caupi (VuChiI) na defesa e no desenvolvimento vegetal e para isso duas abordagens foram conduzidas. A primeira consistiu no silenciamento do gene que codifica esta proteÃna em plantas de feijÃo-caupi. Nos experimentos de silenciamento gÃnico foram utilizados meristemas apicais de plÃntulas de feijÃo-caupi, que foram entÃo bombardeados com micropartÃculas portando um vetor de silenciamento (pKANNIBAL), onde foi clonada uma construÃÃo em grampo (intron harpin) do gene de VuChiI. As plantas regeneradas em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS) contendo o herbicida imazapyr, como agente de seleÃÃo, foram analisadas por PCR, o que resultou na confirmaÃÃo da transformaÃÃo genÃtica de cinco plantas, a partir de 1.092 meristemas apicais bombardeados. O RNA foi extraÃdo das plantas transformadas e utilizado em anÃlises de Northern blot que possibilitou a detecÃÃo de siRNAs no RNA total extraÃdo das plantas putativamente transgÃnicas. Apenas uma das plantas transformadas produziu uma vagem contendo seis sementes, das quais apenas uma germinou. As plantas transformadas apresentaram ciclo de vida de mais de 365 dias enquanto que o esperado à de 65-70 dias. Com base nos resultados sugere-se que o silenciamento da quitinase de classe I de feijÃo-caupi pode ter promovido alteraÃÃo no desenvolvimento da planta. A segunda estratÃgia de transformaÃÃo genÃtica consistiu no co-cultivo de discos foliares de tabaco com suspensÃo de Agrobacterium tumefaciens LB4404, com o intuito de expressar a proteÃna recombinante no espaÃo extracelular das plantas regeneradas. Essa estratÃgia tem como objetivo fazer com que a proteÃna entre em contato com o fungo antes mesmo que este agente patogÃnico penetre na cÃlula vegetal. Para tanto, o inserto referente à quitinase de feijÃo-caupi foi clonado no vetor binÃrio pCAMBIA1305.2 sob controle do promotor CaMV35S e fundido ao peptÃdeo sinal GRP (glycine-rich protein de Oryza sativa), que permite a secreÃÃo da proteÃna recombinante via apoplasto. Foram produzidas trÃs linhagens de plantas que tiveram a transformaÃÃo genÃtica confirmada por PCR. As sementes obtidas das plantas transformadas, geraÃÃo R1, foram semeadas em meio seletivo para a anÃlise da transmissÃo do transgene. O teste de X2 indicou que o transgene foi transmitido para a progÃnie em proporÃÃes Mendelianas. Os modelos experimentais desenvolvidos neste trabalho poderÃo contribuir para a elucidaÃÃo dos papÃis biolÃgicos da quitinase de classe I de feijÃo-caupi.