ExpressÃo e regulaÃÃo da quinase celular intestinal (ICK) em modelo de desnutriÃÃo in vivo e in vitro

• Autor(a) principal: Luis Antonio de Oliveira Alves
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=12743
• topic: BIOQUIMICA DA NUTRICAO

A desnutriÃÃo pode afetar a arquitetura intestinal, causando atrofia da mucosa e comprometendo o turnover epitelial. Embora o intestino seja capaz de responder compensatoriamente à desnutriÃÃo, os mecanismos moleculares pelos quais o intestino responde à privaÃÃo proteica nÃo estÃo completamente esclarecidos. A quinase celular intestinal (ICK) à uma proteÃna altamente conservada do tipo serina/treonina e um novo componente das vias de sinalizaÃÃo que regulam a proliferaÃÃo celular na cripta intestinal. Para avaliar o papel da resposta intestinal compensatÃria à privaÃÃo proteica, regulada pela ICK, foi medida a ativaÃÃo de vias moleculares relacionadas à proliferaÃÃo e sobrevivÃncia celulares, como a via canÃnica Wnt/β-catenina, a via da proteÃna alvo da rapamicina em mamÃferos (mTOR), vias da proteÃna-quinase ativada por mitÃgeno (MAPK) e da proteÃna quinase B (PKB/Akt), bem como a expressÃo de marcadores para cÃlulas-tronco intestinais (LgR-5 e Bmi1) por imunoblotting num modelo in vivo em camundongos fÃmeas C57BL/6J submetidas à uma dieta hipoproteica (contendo 2% de proteÃna) por cinco dias e controles nutridos recebendo dieta padrÃo. TambÃm foi realizado um estudo in vitro utilizando cÃlulas HCT-8 de adenocarcinoma ileocecal humano desafiadas com meio padrÃo com restriÃÃo de soro fetal bovino (0-1%) para avaliar a resposta da ICK na presenÃa ou nÃo de fatores trÃficos intestinais como glutamina (2mM), alanil-glutamina (10 e 50 mM) e zinco (10 e 50μM), alÃm de caseÃna e albumina sÃrica bovina (BSA) na concentraÃÃo de 0,25 e 0,5% no meio, respectivamente. A anÃlise de RNAm foi feita para avaliar o transcrito de ICK por q-PCR, apÃs privaÃÃo proteica. No intuito de avaliar o efeito dessa quinase sobre a proliferaÃÃo celular e apoptose, foi realizado o silenciamento do gene da ICK com uso de RNA de interferÃncia em cÃlulas HCT-8. A viabilidade celular foi avaliada com base na exclusÃo do azul de tripan. Posteriormente, foram realizados testes de western blot para caspase 3 e 9, PARP-clivada, alÃm de anexina V por citometria de fluxo para avaliar apoptose, assim como western blot para via Wnt/β-catenina e ciclina D1 no intuito de medir os mecanismos relacionados à proliferaÃÃo celular. Dessa forma, foi identificado um aumento significativo e transitÃrio nos nÃveis intestinais de ICK na desnutriÃÃo induzida pela raÃÃo hipoproteica, concomitante com a ativaÃÃo de vias moleculares relacionadas à proliferaÃÃo e sobrevivÃncia, bem como o aumento da expressÃo de marcadores para cÃlulas-tronco intestinais. Esse trabalho tambÃm documentou que a privaÃÃo proteica, induzida por baixa concentraÃÃo de soro, aumenta a expressÃo de ICK em cÃlulas HCT-8, efeito que foi revertido pela adiÃÃo de BSA no meio. O mesmo resultado, nÃo foi observado com outros compostos como glutamina, alanil-glutamina e zinco. Apesar do aumento da expressÃo da ICK apÃs privaÃÃo proteica, nÃo houve diferenÃa significativa da sua transcriÃÃo quando comparado com os controles. O silenciamento do gene de ICK reduziu significativamente a sinalizaÃÃo da via Wnt-β-catenina e ciclina D1 em cÃlulas HCT-8 com aumento da apoptose por um mecanismo dependente de caspases. Os resultados sugerem que o aumento da expressÃo de ICK em resposta à privaÃÃo proteica à um mecanismo de proteÃÃo que limita a apoptose e suporta a proliferaÃÃo celular epitelial na desnutriÃÃo.