Estudo da atividade enzimÃtica e dos efeitos do veneno da serpente Bothropoides insularis sobre macrÃfagos RAW 264.7 in vitro

• Autor(a) principal: Ramon RÃseo Paula Pessoa Bezerra de Menezes
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=11372
• topic: Macrophages; Cytotoxins; FARMACOLOGIA

Em todo o mundo, sÃo registrados mais de 3 milhÃes de acidentes envolvendo picadas de animais peÃonhentos por ano, das quais 125 a 150 mil culminam em Ãbito. No Brasil, a maioria dos casos ocorre com serpentes dos gÃneros Bothrops e Bothropoides, provocando uma grande variedade de complicaÃÃes locais e sistÃmicas, dentre os quais se destacam efeito mionecrÃtico, coagulaÃÃo intravascular disseminada, citotoxicidade, insuficiÃncia renal aguda e sepse. A serpente Bothropoides insularis à uma espÃcie nativa da Ilha de Queimada Grande, cujo veneno apresenta efeito tÃxico acentuado em diversos modelos experimentais. Entretanto, pouco à conhecido a respeito do efeito dessa peÃonha sobre cÃlulas com funÃÃo de defesa, nem o quanto esse efeito pode influenciar na toxicidade observada in vivo. O presente trabalho teve como objetivo investigar as alteraÃÃes celulares induzidas pelo veneno total da serpente Bothropoides insularis (BinsVT) sobre macrÃfagos murinos da linhagem RAW 264.7. Nesse contexto, foi realizada a determinaÃÃo da atividade proteolÃtica e da produÃÃo de perÃxido de hidrogÃnio in vitro de BinsVT atravÃs de reaÃÃes colorimÃtricas. Os resultados demonstraram alta atividade catalÃtica em ambos os testes, sugerindo que os efeitos biolÃgicos desse veneno podem estar relacionados à presenÃa de enzimas como metaloproteinases (svMPs) e L-aminoÃcido oxidases (LAAOs) em concentraÃÃes relevantes nas condiÃÃes experimentais adotadas. A determinaÃÃo do potencial citotÃxico foi realizada pelo mÃtodo de reduÃÃo do MTT, um teste de avaliaÃÃo da capacidade oxirredutora das cÃlulas, apÃs 2, 6, 12 e 24 horas de incubaÃÃo. Foi observado efeito citotÃxico em altas concentraÃÃes de forma tempo-dependente, com morte celular mais pronunciada nas concentraÃÃes de 200 e 100 Âg/mL apÃs 12 e 24 horas de tratamento. Nas menores concentraÃÃes estudadas, ocorreu um aumento gradativo da viabilidade celular, com valores percentuais em torno de 200% em relaÃÃo ao grupo controle nos grupos tratados por 24 horas. Esse resultado sugere a presenÃa de efeito proliferativo de BinsVT sobre essa linhagem celular. Em seguida, a atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante de cultivo dos grupos experimentais foi determinado para investigaÃÃo de lise celular induzida por BinsVT. Foi verificado aumento significativo da atividade dessa enzima em todos os grupos testados, sugerindo a coexistÃncia de fraÃÃes com efeito proliferativo e citotÃxico, e a concentraÃÃo e o tempo de exposiÃÃo do veneno determinam qual irà prevalecer. Para avaliaÃÃo morfolÃgica das cÃlulas RAW 264.7 apÃs exposiÃÃo à substÃncia em estudo, os experimentos foram realizados na superfÃcie de lamÃnulas, para coloraÃÃo com May-Grunwald Giemsa. Os grupos experimentais foram analisados por microscopia Ãptica e as caracterÃsticas morfolÃgicas mais representativas foram fotomicrografadas. Foram observadas diversas alteraÃÃes morfolÃgicas, tais como aparecimento de fragmentos celulares e nÃcleos desnudos, cÃlulas vacuolizadas, reduÃÃo do volume celular e aumento de projeÃÃes citoplasmÃticas. Por fim, o mecanismo de morte celular induzida por BinsVT foi avaliado por citometria de fluxo, pela marcaÃÃo com o iodeto de propÃdio (PI) e a anexina V-FITC. A anÃlise revelou a presenÃa de envolvimento necrÃtico e apoptÃtico no efeito citotÃxico da substÃncia, alÃm do aparecimento de cÃlulas marcadas duplamente com PI e anexina-FITC, indicando a ocorrÃncia de apoptose tardia. Em conclusÃo, BinsVT apresenta efeito citotÃxico sobre macrÃfagos RAW 264.7, com aparente envolvimento de necrose e apoptose, alÃm de provÃvel efeito estimulatÃrio sobre essas cÃlulas, de forma concentraÃÃo- e tempo-dependente. Esses efeitos podem estar relacionados Ãs atividades enzimÃticas encontradas in vitro.