ExpressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris de uma quitinase antifÃngica da famÃlia 19 das glicosÃdeo hidrolases de Chromobacterium violaceum

• Autor(a) principal: Denise Rocha Nepomuceno
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC
• Texto Completo: http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=9171
• topic: Pichia pastoris; Chromobacterium violaceum; quitinase; Pichia pastoris; Chromobacterium violaceum; chitinase; BIOQUIMICA

Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, saprÃfita, nÃo patogÃnica e de vida livre. A anotaÃÃo do genoma dessa espÃcie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicaÃÃes em diversas Ãreas. Dentre esses produtos estÃo vÃrias quitinases, enzimas capazes de degradar quitina, um polissacarÃdeo de N-acetil-β-D-glucosamina presente na parede celular de muitos fungos e no exoesqueleto de insetos e crustÃceos. As quitinases sÃo de grande interesse biotecnolÃgico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados Ãteis, e tambÃm para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrÃcolas. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterizaÃÃo bioquÃmica, estrutural e biolÃgica de uma quitinase recombinante (CV1897), da famÃlia 19 das glicosil hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A sequÃncia completa da ORF CV1897 (codificando CV1897PS+, com o peptÃdeo sinal nativo) foi amplificada por reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET302/NT-His e pPICZαA para expressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A sequÃncia parcial da ORF (rCV1897PS-, sem o peptÃdeo sinal nativo) foi expressa apenas em P. pastoris. Em E. coli, a rCV1897PS+ foi produzida principalmente em corpos de inclusÃo, de forma insolÃvel e inativa. Em P. pastoris, as proteÃnas (rCV1897PS+ e rCV1897PS-) foram secretadas para o meio de cultura de forma solÃvel e funcional. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em nÃquel imobilizado, com rendimentos de 1,8 mg/L (rCV1897PS+) e 2,1 mg/L (rCV1897PS-), sendo detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presenÃa de SDS (SDS-PAGE) como duas isoformas com massas moleculares diferentes (43,2 kDa e 51,4 kDa; 44 e 50 kDa, respectivamente). A quitinase recombinante (CV1897PS+) mostrou atividade Ãtima em Ph 5,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de atà 40 ÂC por 30 min. A Rcv1897 apresentou atividade quitinÃsica frente a quitina coloidal e glicol-quitina (em gel SDS-PAGE). Os espectros de dicroÃsmo circular revelaram que a estrutura da proteÃna possui predominantemente estrutura secundÃria do tipo α-hÃlice (37%), com 26% de fitas-β e 38% de estrutura desordenada. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna foi produzida na sua conformaÃÃo enovelada. A rCV1897PS+ inibiu a germinaÃÃo de conÃdios e o crescimento micelial dos fungos fitopatogÃnicos Penicillium herquei e Colletotrichum lindemuthianum. As quitinases rCV1897PS+ e rCV1897PS- em associaÃÃo com o fluconazol atuaram de forma sinÃrgica contra diferentes cepas da levedura patogÃnica Candida tropicalis. Os estudos bioquÃmicos, estruturais e biolÃgicos da rCV1897 poderÃo ser Ãteis para aplicaÃÃo biotecnolÃgica dessa enzima.