Estabelecimento de carioplastos e citoplastos de catetos, pecari tajacu (linnaeus, 1758), visando a clonagem por transferência nuclear de célula somática em taiassuídeos

• Autor(a) principal: Borges, Alana Azevedo
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFERSA
• Texto Completo: https://repositorio.ufersa.edu.br/handle/prefix/5589
• topic: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA; Vida selvagem; Clonagem; Biobancos; Ciclo celular; Ativação oocitária; Produção de embriões; Wild life; Cloning; Biobanks; Cell cycle; Oocyte activation; Embryo production

O direcionamento dos primeiros passos para a realização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) em catetos garantirá uma ferramenta efetiva na conservação da espécie, perante sua acelerada diminuição populacional e sua atividade ecológica indispensável para o ecossistema. Para tanto, a presente tese foi dividida em duas etapas (três experimentos por etapa), sendo a primeira etapa o estudo das células doadoras de núcleo ou carioplastos e a segunda etapa, o estudo das células doadoras de citoplasma ou citoplastos. Assim, diante da importância de carioplastos de qualidade reconhecida para a TNCS, nós inicialmente estabelecemos cinco linhagens de fibroblastos de catetos, monitorando a viabilidade, atividade metabólica e estresse oxidativo, de acordo com os efeitos do número de passagens (primeira, terceira e décima) e criopreservação. Embora não haja efeito desses critérios sobre a viabilidade, células em décima passagem tiveram uma redução de seu metabolismo. Adicionalmente, células congeladas/descongeladas tiveram um aumento no número de espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. Além disso, sabendo da importância de manter estas células armazenadas em um biobanco de maneira adequada, nós otimizamos a solução crioprotetora utilizada na congelação lenta de fibroblastos de catetos. Deste modo, a solução composta por 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 0,2 M de sacarose e 50% de soro fetal bovino (SFB) foi considerada a solução mais eficiente em manter a viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo e níveis adequados de estresse oxidativo de células somáticas de catetos, quando comparada a soluções na ausência de sacarose e com 10% de SFB em diferentes combinações. Finalmente, um passo essencial no estabelecimento dos carioplastos para a TNCS consiste na sincronização das células em G0/G1 do ciclo celular. Deste modo, nós avaliamos diferentes métodos de sincronização do ciclo celular: (i) supressão de soro (SS) por um a quatro dias, (ii) inibição por contato (IC) por um a três dias e (iii) agentes químicos [DMSO, 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), ciclohexamida (CHX), e citocalasina B (CB)] por um a dois dias, em termos de seus efeitos sobre a sincronização em G0/G1 e viabilidade. Assim, nós observamos que a IC por três dias foi o método mais eficiente para sincronização do ciclo celular e manutenção da viabilidade de fibroblastos de catetos. Portanto, com estes três experimentos, nós estabelecemos a etapa de carioplastos da TNCS de catetos, obtendo células de qualidade e aptas a serem usadas como doadoras de núcleo. Na segunda etapa, nós, inicialmente, adequamos as condições de maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, avaliando o tempo de MIV e o efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) sobre a habilidade meiótica. Assim, nós concluímos que 48 h é o período adequado para a MIV de oócitos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico. Ainda, observou-se que o EGF pode ser utilizado para otimizar o meio de MIV. Finalmente, no terceiro experimento, nós avaliamos a habilidade de desenvolvimento destes oócitos após ativação artificial, usando a ionomicina como ativador primário e comparando diferentes ativadores secundários (6-DMAP, CHX e CB). Nós verificamos que a ativação química usando ionomicina e 6-DMAP foi a mais eficiente combinação, tendo esta tese alcançado como resultado significativo, uma taxa de 27,6% de blastocistos de catetos derivados da ativação oocitária artificial. Em síntese, nós obtivemos carioplastos e citoplastos que poderão ser empregados na TNCS de catetos, deixando a ponto as etapas fundamentais para a clonagem desta espécie. Ainda, destaca-se que os conhecimentos aqui gerados poderão ser aplicados em estudos de fecundação in vitro, compreensão do desenvolvimento embrionário, produção de células induzidas à pluripotência, e ensaios de toxicidade. Portanto, este trabalho foi um grande passo para a conservação de catetos