Entendendo os mecanismos moleculares envolvidos com a adesão do osteoblastos: possível envolvimento da proteína tirosina fosfotase de baixa massa

• Autor(a) principal: Fernandes, Gustavo Vicentis de Oliveira
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense (RIUFF)
• Texto Completo: https://app.uff.br/riuff/handle/1/9740
• topic: Osteoblastos; Adesão; Transdução de sinal; LMWPTP; FAK; Src.; Osteoblasto; Proteína tirosina fosfatase; Transdução de sinal; Adesão celular; Osteoblasts; Adhesion; Signal transduction; LMWPTP; FAK; Src

A interação das células com seu ambiente externo provoca modulação de diferentes vias de sinalização em cascata, que culmina em uma resposta específica. Este mecanismo de transdução de sinal é regido predominantemente por mecanismos transientes de fosforilação e desfosforilação em resíduos de tirosina (Y), executados por quinases (PTK) e fosfatases (PTP), respectivamente. Com a finalidade de conhecer os mecanismos de transdução de sinais envolvidos com a adesão de osteoblastos, nosso grupo de pesquisa tem estudado o envolvimento de diferentes proteínas e proposto um mecanismo global deste evento biológico. A despeito dos últimos artigos documentando a adesão de osteoblastos, pouco se sabe sobre o envolvimento de Espécies Reativas de Oxigênio (Reactive Oxygen Species - ROS) e Proteína Tirosina Fosfatase de Baixo Peso Molecular (Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase - LMWPTP) nestes eventos. Assim, este trabalho preocupou-se em estudar o envolvimento de ROS e LMWPTP durante adesão de osteoblastos, aventando a possibilidade de ROS modular a atividade de LMWPTP. Assim, células MC3T3-E1 (pré-osteoblastos) foram plaqueadas e amostras biológicas coletadas após 30 minutos e 2 horas. Inicialmente foi feito uma análise das modificações morfológicas destas células através de microscopia de confocal. Nossos dados confirmaram dados previamente publicados de que, durante estes eventos iniciais de adesão de osteoblastos, há modificações morfológicas significantes, despertando o interesse de conhecer os mecanismos de transdução de sinais responsáveis por estas modificações. Para avaliar a quantidade de peróxido de hidrogênio (H2O2) utilizamos citometria de fluxo, através do método de DHR 123. Qualitativamente, nossos resultados mostraram que aos 30 minutos a quantidade de H2O2 era maior do que àquela encontrada no período de 2 horas. Avaliando posteriormente a fosforilação de FAK no resíduo Y397 e de Src no resíduo Y416, mostramos que ambos eram maior no período de 30 minutos, sugerindo a atividade de uma PTP específica, que talvez fosse modulada pela sinalização de ROS. A despeito de sua expressão permanecer inalterada nos 2 períodos de análise, sugerimos em testes funcionais que LMWPTP era capaz de controlar ambas fosforilações em Y (416 e 397). Estes testes se basearam nas abordagens de silenciamento e super-expressão de LMWPTP, com posterior análise dos níveis de fosforilações por immunoblotting. Além disso, avaliamos a atividade de catalase e superóxido dismutase nestes períodos e verificamos que ambas estavam com atividade aumentada no período de 2 horas, sugerindo controle da quantidade de ROS. Juntos, esses dados sugerem que ROS é capaz de modular a fosforilação de FAK e Src através do controle direto da atividade de LMWPTP. Além disso, sugerimos que durante a adesão de osteoblastos há uma interação supra-molecular de FAK/Src/LMWPTP, formando um complexo capaz de controlar respostas transientes e imediatas via ativação de integrinas durante estes eventos