Imobilização da enzima Hipoxantina-Guanina Fosforribosil Transferase de Mycobacterium tuberculosis para o desenvolvimento de métodos de triagem

• Autor(a) principal: Souza, Thaysa Martins de
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense (RIUFF)
• Texto Completo: http://app.uff.br/riuff/handle/1/24596
• topic: Mycobacterium tuberculosis; cromatografia líquida; HGPRT; imobilização enzimática; Mycobacterium tuberculosis; Cromatografia a líquido de alta eficiência; Engenharia química; Mycobacterium tuberculosis; liquid chromatography; HGPRT; enzymatic immobilization

A tuberculose humana (TB) tem como principal agente a Mycobacterium tuberculosis (Mt). Na busca por substâncias bioativas contra a tuberculose, tem-se como biomolécula alvo a enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT), que catalisa a reação, dependente de Mg2+, entre osforibosilpirofosfato (PRPP) e hipoxantina, para formação de inosina-5-monofosfato (IMP) e pirofosfato inorgânico. Com isso, novos inibidores de enzimas chave de processos bioquímicos essenciais para o desenvolvimento da micobactéria têm sido rastreados. Dentre as estratégias mais modernas de ensaios de triagem de inibidores, o uso de enzimas imobilizadas é uma alternativa vantajosa devido à possibilidade de sua reutilização. Assim, este projeto visa o desenvolvimento de um método de triagem de alta eficiência baseado na cromatografia de bioafinidade para a rápida identificação de inibidores da enzima HGPRT, como potenciais fármacos para o tratamento da tuberculose. A enzima foi imobilizada covalentemente em partículas magnéticas de Fe3O4 com terminação amino através do uso do glutaraldeído como espaçador. O monitoramento da atividade da enzima imobilizada foi realizado através da quantificação direta do IMP formado na catálise enzimática. Para isso, foi desenvolvido um método cromatográfico para a separação de IMP, hipoxantina e PRPP em uma coluna analítica C18. A melhor separação obtida envolveu o uso de uma coluna C18, solução 1% TEA pH 6,0:MeOH (97:3) como fase móvel a uma vazão de 0,8 mL.min-1. O método desenvolvido foi validado para viabilizar a quantificação do IMP formado através da avaliação das seguintes figuras de mérito: linearidade (y= 6249,3x - 39857, R2= 0,998), exatidão (94% – 123%), precisão (4,91 – 5,94%), seletividade e reprodutibilidade. Para a otimização do ensaio enzimático foram avaliadas quantidades diferentes de partículas magnéticas contendo a enzima imobilizada e os tempos reacionais, sendo que a melhor condição estudada envolveu o uso de 0,5 mg de partículas magnéticas recobertas com a enzima imobilizada e 30 segundos de tempo reacional. O estudo cinético foi realizado para se obter o valor da constante KM para os substratos, de acordo com a equação de Michaelis-Menten. Para o PRPP foi encontrado o valor de 163,7 μmol.L-1 e para a hipoxantina de 24,9 μmol.L-1. Além disso, a enzima se mostrou estável durante um período de 56 dias e o rendimento da imobilização foi de 100%. Assim, pode-se concluir que a enzima foi imobilizada com sucesso na superfície das partículas magnéticas, com retenção de sua atividade catalítica e elevada estabilidade, sendo, portanto, uma estratégia promissora para a triagem de novos inibidores enzimáticos específicos.