Padronização da RT-PCR Duplex, Multiplex e Nested para detecção do vírus zika, dengue e chikungunya
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Data de Publicação: | 2017 |
Tipo de documento: | Trabalho de conclusão de curso |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFGD |
Texto Completo: | http://repositorio.ufgd.edu.br/jspui/handle/prefix/4102 |
Resumo: | Os vírus zika (ZIKV), dengue (DENV) e chikungunya (CHIKV) são as arboviroses mais prevalentes nas Américas. Elas compartilham o mesmo vetor, o mosquito Aedes aegypti, se sobrepõem em áreas endêmicas e possuem sintomas clínicos semelhantes nos estágios iniciais da doença. Essas, arboviroses nos últimos anos, aumentaram sua área de endemicidade e são consideradas como um grande problema de saúde pública. Isso reforçou a necessidade do desenvolvimento de testes laboratoriais para confirmar a infecção por essas viroses. Esses testes devem ser rápidos, específicos, eficientes, econômicos e fáceis de serem realizados, permitindo que possa ser feita a identificação dos vírus nos pacientes que apresentarem os sintomas da doença. Este trabalho propôs a padronização de protocolos para a identificação dos gêneros Alphavirus e Flavivirus, além da detecção simultânea dos vírus ZIKV, DENV e CHIKV em uma única reação e diferenciação dos sorotipos do vírus DENV. Para isso foram utilizados nove pares de oligonucleotídeos iniciadores já descritos na literatura que se mostraram sensíveis e específicos à sequência alvo dos vírus. Três modalidades diferentes da RT-PCR foram utilizadas para atingir este propósito: a RT-PCR Duplex, a RT-PCR Multiplex e a Nested RT-PCR. Na reação RT-PCR Duplex foi possível observar apenas o produto amplificado pelo par de oligonucleotídeos iniciadores FG1/FG2, mostrando que o par de oligonucleotídeos iniciadores cM3W/M2W apresentou baixa sensibilidade. Na reação RT-PCR Multiplex, foi possível observar apenas os produtos amplificados pelos oligonucleotídeos iniciadores DEN-F/DEN-CR e ZIKVEN-F/ZIKVEN-R, porém não foi possível observar o produto dos oligonucleotídeos iniciadores CHIKF/CHIKR, no entanto, quando a reação foi realizada separadamente foi possível observar todos os produtos amplificados por cada um dos oligonucleotídeos iniciadores. Na reação Nested RT-PCR, observamos apenas os produtos amplificados pelos oligonucleotídeos iniciadores DEN-F/DEN-CR, DEN-1 e DEN-2. Esses resultados mostram que ainda é necessário a otimização dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados e das reações para aumentar a sensibilidade dos testes realizados neste estudo para que se possa padronizar um teste para a detecção das três arboviroses aqui descritas. |
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Essas, arboviroses nos últimos anos, aumentaram sua área de endemicidade e são consideradas como um grande problema de saúde pública. Isso reforçou a necessidade do desenvolvimento de testes laboratoriais para confirmar a infecção por essas viroses. Esses testes devem ser rápidos, específicos, eficientes, econômicos e fáceis de serem realizados, permitindo que possa ser feita a identificação dos vírus nos pacientes que apresentarem os sintomas da doença. Este trabalho propôs a padronização de protocolos para a identificação dos gêneros Alphavirus e Flavivirus, além da detecção simultânea dos vírus ZIKV, DENV e CHIKV em uma única reação e diferenciação dos sorotipos do vírus DENV. Para isso foram utilizados nove pares de oligonucleotídeos iniciadores já descritos na literatura que se mostraram sensíveis e específicos à sequência alvo dos vírus. Três modalidades diferentes da RT-PCR foram utilizadas para atingir este propósito: a RT-PCR Duplex, a RT-PCR Multiplex e a Nested RT-PCR. 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Esses resultados mostram que ainda é necessário a otimização dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados e das reações para aumentar a sensibilidade dos testes realizados neste estudo para que se possa padronizar um teste para a detecção das três arboviroses aqui descritas.Zika (ZIKV), Dengue (DENV) and Chikungunya (CHIKV) viruses are the most prevalent arboviruses in the Americas. They share the same vector, the Aedes aegypti mosquito, overlap in their endemic areas and have similar clinical symptoms, especially in the initial stages of the infection. In recent years, these arboviruses have increased their area of endemicity and it has been considered a major public health problem. This reinforced the need for the development of laboratory tests to accurately confirm infections by these viruses. These tests should be rapid, specific, efficient, cost-effective and easy to perform, allowing identification of viruses in patients presenting the disease symptoms. This work proposes the standardization of protocols for the identification of the Alphavirus and Flavivirus genera, as well as the simultaneous detection of ZIKV, DENV and CHIKV viruses in a single reaction and differentiation of DENV serotypes. For this, nine pairs of primers already described in the literature which were sensitive and specific to the virus target sequence were used. Three different RT-PCR modalities were used to achieve this purpose, Duplex RT-PCR, Multiplex RT-PCR and Nested RT-PCR. In Duplex RT-PCR reaction, it was only possible to observe the product amplified by primer pair FG1 / FG2, showing that primer pair cM3W / M2W was not as sensitive. In Multiplex RT-PCR reaction, it was only possible to observe the products amplified by DEN-F / DEN-CR and ZIKVEN-F / ZIKVEN-R primers, but CHIKF / CHIKR product was not observed, however, when the reaction was performed separately it was possible to observe all products amplified by each of the primers. In Nested RT-PCR reaction, it was possible to observe only the products amplified by the primers DEN-F / DEN-CR, DEN-1 and DEN-2. These results show that it is still necessary to optimize the primers used and the reactions to increase the sensitivity of the tests performed in this study so that a test can be standardized for the detection of the three arboviruses described herein.Submitted by Alison Souza (alisonsouza@ufgd.edu.br) on 2020-09-15T12:08:34Z No. of bitstreams: 1 RenataGoisdeMello.pdf: 1151613 bytes, checksum: c2110b4c0bbada48d9d27e1517dffd98 (MD5)Made available in DSpace on 2020-09-15T12:08:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RenataGoisdeMello.pdf: 1151613 bytes, checksum: c2110b4c0bbada48d9d27e1517dffd98 (MD5) Previous issue date: 2017-04-06porUniversidade Federal da Grande DouradosUFGDBrasilFaculdade de Ciências Biológicas e AmbientaisCNPQ::CIENCIAS BIOLOGICASInfecções por arbovirusTestes laboratoriaisReação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase ReversaArbovirus infectionsLaboratory testReverse Transcriptase Polymerase Chain ReactionPadronização da RT-PCR Duplex, Multiplex e Nested para detecção do vírus zika, dengue e chikungunyainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/bachelorThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFGDinstname:Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD)instacron:UFGDTEXTRenataGoisdeMello.pdf.txtRenataGoisdeMello.pdf.txtExtracted texttext/plain78758https://repositorio.ufgd.edu.br/jspui/bitstream/prefix/4102/3/RenataGoisdeMello.pdf.txtbbfc4fca5594144a5c959e661d0d5c0aMD53LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81866https://repositorio.ufgd.edu.br/jspui/bitstream/prefix/4102/2/license.txt43cd690d6a359e86c1fe3d5b7cba0c9bMD52ORIGINALRenataGoisdeMello.pdfRenataGoisdeMello.pdfapplication/pdf1151613https://repositorio.ufgd.edu.br/jspui/bitstream/prefix/4102/1/RenataGoisdeMello.pdfc2110b4c0bbada48d9d27e1517dffd98MD51prefix/41022023-09-14 02:31:01.492oai:https://repositorio.ufgd.edu.br/jspui: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufgd.edu.br/jspui:8080/oai/requestopendoar:21162023-09-14T06:31:01Repositório Institucional da UFGD - Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD)false |
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