Development of blast resistant rice plants using CRISPR / Cas9 system for genome editing

• Autor(a) principal: Távora, Fabiano Touzdjian Pinheiro Kohlrausch
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFJF
• Texto Completo: https://doi.org/10.34019/ufjf/te/2021/00037; https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/13157
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS; CRISPR; Gene de susceptibilidade; Interação planta-fungo; Proteômica shotgun; Silenciamento gênico; Gene silencing; Plant-fungus interaction; Proteomic shotgun; Susceptibility gene

O arroz (Oryza sativa L.) consiste na principal cultura alimentar de mais da metade da população mundial. Entretanto, esta cultura tem sido severamente atingida pela brusone, uma devastadora doença de plantas causada pelo fungo Magnaporthe oryzae. Dessa forma, o desenvolvimento de cultivares de arroz com maior resistência à brusone consiste em um dos principais focos dos programas de melhoramento. No entanto, devido à complexa biologia do patógeno, cultivares de arroz geneticamente resistentes ao fungo tornam-se suscetíveis em um curto período de tempo. O nocaute (deleção) de genes de suscetibilidade no genoma do arroz representa uma notável estratégia para a obtenção de uma resistência mais ampla e duradoura contra o fungo M. oryzae. O presente estudo teve como objetivo utilizar a tecnologia de edição genômica - sistema CRISPR/Cas9, para o nocaute de genes de arroz envolvidos na susceptibilidade à infecção fúngica. A partir de resultados anteriores de transcriptômica de duas linhagens semi-isogênicas de arroz - NILs submetidas a infecção por M. oryzae, foram selecionados potenciais genes de suscetibilidade. A prospecção por candidatos à edição gênica foi complementada por uma análise proteômica shotgun comparativa do perfil de proteínas da interação entre as NILs IRBLi-F5 (suscetível) e IRBL5-M (resistente) em estágios iniciais da infecção por M. oryzae, que revelou um conjunto específico de proteínas potencialmente associadas à suscetibilidade. Após a caracterização e validação da expressão gênica por RTqPCR dos candidatos mais proeminentes, os genes-alvos OsDjA2, OsERF104 e OsPyl5, foram selecionados e submetidos a validação funcional via silenciamento gênico in planta, utilizando oligonucleotídeos antissenso (ASO), onde se observou notável redução dos sintomas foliares da doença na interação compatível. Em seguida, a variedade-modelo de arroz cv. Nipponbare foi transformada com os vetores CRISPR/Cas9 visando o nocaute, independente, de cada um dos genes-alvo. Plantas de arroz da geração T1 e homozigotas para mutação-nula (perda de função) foram testadas quanto a resistência ao fungo M. oryzae. Conforme esperado, plantas editadas mostraram considerável redução dos sintomas da doença em relação às linhagens controle. Espera-se que os resultados obtidos contribuam para a geração de cultivares de arroz resistentes à brusone, além de lançar luz sobre novos potenciais genes de susceptibilidade à M. oryzae