Identificação de proteínas e validação de genes envolvidos na resistência de Brassica oleracea a Xanthomonas campestris pv. campestris

• Autor(a) principal: Santos, Cristiane dos
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFJF
• Texto Completo: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/10231
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA; Interação planta-patógeno; Podridão negra; Proteômica; Superexpressão gênica; Repolho; Plant-pathogen interaction; Cabbage; Proteome; Genic overexpression; Cabbage

A determinação da função gênica, visando a confirmação do envolvimento de genes em determinada condição biológica, ainda é um desafio da era pós-genômica, sendo que a análise proteômica se mostra uma técnica poderosa para essa finalidade. O enriquecimento de organelas também pode contribuir para a identificação de proteínas menos abundantes na análise de amostras complexas de plantas. No presente estudo, folhas jovens de Brassica oleracea var. capitata (repolho) de cultivares moderadamente resistente (Astrus Plus) e suscetível (Veloce) foram infiltradas com suspensão de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), (solução NaCl 0,85% e Xcc, OD600=0,6) e coletadas 24 h após a infecção. Para a condição controle, folhas de ambas as cultivares foram infiltradas com solução de NaCl 0,85%. As proteínas foram extraídas, do extrato de folhas e cloroplastos, com fenol e precipitadas em acetato de amônio em metanol. As amostras foram analisadas por LC-MS/MS e os espectros gerados foram analisados com os softwares Progenesis QI e PEAKS7® para identificação e quantificação de proteínas. Após a comparação da cultivar resistente inoculada com a não inoculada (RI:RC) foram identificadas 2680 proteínas, enquanto 2686 proteínas foram encontradas na comparação entre a cultivar suscetível inoculada comparada ao controle (SI:SC). Mais de 300 proteínas diferencialmente abundantes, em ambas as cultivares, foram identificadas. Do total geral, o enriquecimento de cloroplasto contribuiu com mais 600 proteínas em RI:RC e mais de 900 em SI:SC, que não foram detectadas nas amostras do extrato de folha. Foram analisados ainda 30 genes por RTq-PCR em ambas as cultivares. Na cultivar resistente, 9 genes tiveram nível de expressão diferencial estatisticamente significante em relação ao controle (7 com expressão aumentada e 2 diminuída) na cultivar resistente, enquanto a cultivar suscetível mostrou 13 genes validados (10 regulados positivamente e 3 negativamente). Entre os genes diferencialmente expressos, com significância estatística, avaliados por RTq-PCR, três genes, potencialmente envolvidos na defesa da planta, foram escolhidos para validação funcional por superexpressão gênica em planta modelo. Os genes de repolho, BoCHB4, BoESP e BoRGP1, expressos em Arabidopsis, foram validados demonstrando expressão aumentada nas plantas transgênicas (578, 22.000 e 7,5 vezes, respectivamente) quando comparado com as plantas não transformadas (wild type-WT). Este trabalho, além de contribuir para o enriquecimento do banco de dados e identificação de proteínas de adaptação ao estresse pela planta, pode fornecer informações de genes candidatos para programas de melhoramento genético.