Desenvolvimento de método de criopreservação de córneas para potencial aplicação em teste de permeabilidade e opacidade da córnea bovina (BCOP)
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Dissertação |
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Texto Completo: | https://doi.org/10.34019/ufjf/di/2021/00339 https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/13705 |
Resumo: | Atualmente, ensaios biológicos devem ser utilizados para avaliação da segurança para a saúde de produtos antes de irem para o mercado. O teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina (BCOP) é um método alternativo ao uso de animais que utiliza córneas bovinas frescas para avaliar o potencial irritante e corrosivo de qualquer substância em nível ocular. A necessidade de sempre ter que usar córneas viáveis faz com que o escalonamento deste teste seja mais difícil. Para superar esse desafio, a criopreservação de córneas pode ser uma possibilidade para se ter bancos de córneas disponíveis em qualquer momento. Apesar do sucesso obtido no congelamento de córneas humanas, o processo de congelamento pode causar danos ao endotélio e em bovinos não são conhecidos protocolos eficientes para esse fim. O objetivo desse trabalho é desenvolver um método de criopreservação de córneas bovinas para aplicação no teste de BCOP. Inicialmente, as córneas foram criopreservadas em meio DMEM com os crioprotetores (CPA) dimetilsulfóxido (DMSO) e etilenoglicol (EG), em combinações com dois adjuvantes, albumina sérica bovina (BSA) e soro bovino (SB). O controle foi feito a partir de córneas frescas e córneas criopreservadas com DMEM e adjuvante. O ensaio de intumescência foi feito para verificar a resistência do endotélio aos CPAs. Posteriormente, elas foram congeladas em duas temperaturas: -20°C e -80°C. Após congelamento, foi realizada a análise macroscópica da opacidade corneana e viabilidade celular pelo método de exclusão com azul de tripan (AT). A área celular do endotélio e a morfologia das células foram avaliadas a partir de coloração com vermelho de alizarina (VA). Além disso, cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina foram realizados para avaliar a integridade das diferentes camadas da córnea após a aplicação dos métodos de criopreservação estudados. Os dados de intumescência e viabilidade celular foram avaliados através de modelos lineares seguindo o critério de Akaike (AICc) e valores de R² (R² = 1 – erro relativo). Os resultados revelaram que as córneas só tiveram aumento de peso, significando um dano à camada endotelial, depois de 6 horas em contato com os CPAs (p < 0,05). Os tratamentos com CPAs foram diferentes do controle (p < 0,05) e os diferentes adjuvantes mantiveram o peso estabilizado, apresentaram diferença entre si (p < 0,05). O SB, que possui BSA em sua composição além de outras proteínas benéficas a criopreservação, foi escolhido como adjuvante para prosseguir o congelamento. A análise macroscópica revelou que o DMSO apresentou melhor transparência corneal. A viabilidade celular endotelial foi maior no tratamento controle, seguido por DMSO e EG, em ambas as temperaturas de congelamento. O congelamento em -20°C teve melhor resposta quando comparada ao -80ºC na viabilidade após criopreservação. Os danos do tratamento EG são evidenciados na análise morfológica e nas análises histológicas. Assim, os dados sugerem que o DMSO no congelamento tem potencial para a criopreservação de córneas bovinas, pois apresentou os melhores resultados nos parâmetros avaliados no presente trabalho. Adicionalmente, o congelamento em -20°C demonstrou potencial uso para a manutenção de córneas bovinas, com a vantagem de facilitar o armazenamento desses materiais em refrigeradores comuns. |
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Para superar esse desafio, a criopreservação de córneas pode ser uma possibilidade para se ter bancos de córneas disponíveis em qualquer momento. Apesar do sucesso obtido no congelamento de córneas humanas, o processo de congelamento pode causar danos ao endotélio e em bovinos não são conhecidos protocolos eficientes para esse fim. O objetivo desse trabalho é desenvolver um método de criopreservação de córneas bovinas para aplicação no teste de BCOP. Inicialmente, as córneas foram criopreservadas em meio DMEM com os crioprotetores (CPA) dimetilsulfóxido (DMSO) e etilenoglicol (EG), em combinações com dois adjuvantes, albumina sérica bovina (BSA) e soro bovino (SB). O controle foi feito a partir de córneas frescas e córneas criopreservadas com DMEM e adjuvante. O ensaio de intumescência foi feito para verificar a resistência do endotélio aos CPAs. Posteriormente, elas foram congeladas em duas temperaturas: -20°C e -80°C. 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O SB, que possui BSA em sua composição além de outras proteínas benéficas a criopreservação, foi escolhido como adjuvante para prosseguir o congelamento. A análise macroscópica revelou que o DMSO apresentou melhor transparência corneal. A viabilidade celular endotelial foi maior no tratamento controle, seguido por DMSO e EG, em ambas as temperaturas de congelamento. O congelamento em -20°C teve melhor resposta quando comparada ao -80ºC na viabilidade após criopreservação. Os danos do tratamento EG são evidenciados na análise morfológica e nas análises histológicas. Assim, os dados sugerem que o DMSO no congelamento tem potencial para a criopreservação de córneas bovinas, pois apresentou os melhores resultados nos parâmetros avaliados no presente trabalho. Adicionalmente, o congelamento em -20°C demonstrou potencial uso para a manutenção de córneas bovinas, com a vantagem de facilitar o armazenamento desses materiais em refrigeradores comuns.Currently, biological assays must be used to assess the health safety of products before they go to market. The Bovine Corneal Opacity and Permeability Test (BCOP) is an alternative method to the use of animals that uses fresh bovine corneas to assess the irritant and corrosive potential of any substance at the ocular level. The need to always have to use viable corneas makes scaling this test more difficult. To overcome this challenge, corneal cryopreservation can be a possibility to have corneal banks available at any time. Despite the success obtained in the freezing of human corneas, the freezing process can damage the endothelium and efficient protocols for this purpose are not known in cattle. This work aims to develop a method of cryopreservation of bovine corneas for application in the BCOP test. Initially, the corneas were cryopreserved in DMEM with cryoprotectants (CPA) dimethylsulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG), in combinations with two adjuvants, bovine serum albumin (BSA) and bovine serum (SB). The control was made from fresh corneas and corneas cryopreserved with DMEM and adjuvant. The tumescence test was performed to verify the resistance of the endothelium to CPAs. Afterwards, they were frozen at two temperatures: -20°C and -80°C. After freezing, macroscopic analysis of corneal opacity and cell viability was performed using the trypan blue (AT) exclusion method. Endothelial cell area and cell morphology were assessed by staining with alizarin red (VA). Furthermore, histological sections stained with hematoxylin and eosin were performed to assess the integrity of the different layers of the cornea after the application of the studied cryopreservation methods. The tumescence and cell viability data were evaluated using linear models following the Akaike criterion (AICc) and R² values (R² = 1 – relative error). The results revealed that the corneas only increased in weight, meaning damage to the endothelial layer, after 6 hours in contact with the CPAs (p < 0.05). Treatments with CPAs were different from the control (p < 0.05) and the different adjuvants kept the weight stabilized, differing from each other (p < 0.05). SB, which has BSA in its composition in addition to other proteins beneficial to cryopreservation, was chosen as an adjuvant to continue freezing. Macroscopic analysis revealed that DMSO had better corneal transparency. Endothelial cell viability was higher in the control treatment, followed by DMSO and EG, at both freezing temperatures. Freezing at -20°C had a better response when compared to -80°C for viability after cryopreservation. The damages of the EG treatment are evidenced in the morphological analysis and in the histological analyses. Thus, the data suggest that freezing DMSO has potential for the cryopreservation of bovine corneas, as it showed the best results in the parameters evaluated in the present work. Additionally, freezing at -20°C showed potential use for the maintenance of bovine corneas, with the advantage of facilitating the storage of these materials in common refrigerators.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorporUniversidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e BiotecnologiaUFJFBrasilICB – Instituto de Ciências BiológicasAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessCNPQ::CIENCIAS BIOLOGICASBCOPCriopreservaçãoCrioprotetoresCórneas bovinasCryopreservationCryoprotectantsBovine corneasDesenvolvimento de método de criopreservação de córneas para potencial aplicação em teste de permeabilidade e opacidade da córnea bovina (BCOP)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisreponame:Repositório Institucional da UFJFinstname:Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)instacron:UFJFORIGINALgeovanadecarvalhoonorato.pdfgeovanadecarvalhoonorato.pdfPDF/Aapplication/pdf2437824https://repositorio.ufjf.br/jspui/bitstream/ufjf/13705/1/geovanadecarvalhoonorato.pdf31ccdf549d01bb322c1aba695c2309f4MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufjf.br/jspui/bitstream/ufjf/13705/2/license_rdfe39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34MD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81748https://repositorio.ufjf.br/jspui/bitstream/ufjf/13705/3/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD53TEXTgeovanadecarvalhoonorato.pdf.txtgeovanadecarvalhoonorato.pdf.txtExtracted texttext/plain109339https://repositorio.ufjf.br/jspui/bitstream/ufjf/13705/4/geovanadecarvalhoonorato.pdf.txt79b850c5f8f39e0e7cb1a4cbe72a1db8MD54THUMBNAILgeovanadecarvalhoonorato.pdf.jpggeovanadecarvalhoonorato.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1194https://repositorio.ufjf.br/jspui/bitstream/ufjf/13705/5/geovanadecarvalhoonorato.pdf.jpg810e673fb7a9ac9d0128918cfd5dc2bbMD55ufjf/137052022-10-31 12:09:16.628oai:hermes.cpd.ufjf.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufjf.br/oai/requestopendoar:2022-10-31T14:09:16Repositório Institucional da UFJF - Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)false |
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