Variabilidade, danos e detecção de Stenocarpella maydis e Stenocarpella macrospora em sementes de milho

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Freitas, Marcos Augusto de
Data de Publicação: 2006
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFLA
Texto Completo: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/2903
Resumo: Fitopatologia
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spelling Variabilidade, danos e detecção de Stenocarpella maydis e Stenocarpella macrospora em sementes de milhoStenocarpella maydis and Stenocarpella macrospora Sutton variability, damage and detection in corn seedMétodo de inoculação de sementesMarcador molecularDiagnoseCromatografiaEspectrometria de massaFungoPrimingRegião ITSMilhoDetecçãoSeed inoculation methodMolecular markerCromatographyMass espectrometryFungiITSMaizeDetectionCNPQ_NÃO_INFORMADOFitopatologiaA podridão do colmo e a podridão espigas do milho (Zea mays L.) causadas pelos fungos Stenocarpella macrospora (Earle) Sutton [Sin. Diplodia macrospora Earle in Bull.] e Stenocarpella maydis (Berk.) Sutton [Sin. Diplodia maydis (Berk.) Sacc.; D. Zeae (Schw.) Lev.] são de ocorrência ampla, abrangendo toda a região de plantio dessa cultura, principalmente nas regiões quentes e úmidas. Esses fitopatógenos afetam a germinação das sementes, causam colapso prematuramente das plantas infectadas na fase reprodutiva e paralisam o processo normal de enchimento de grãos, com conseqüênte queda da produtividade. A presença desses fungos nos grãos de milho reduz a qualidade nutricional das rações, além de poduzirem micotoxinas. Normalmente são necessários quatorze dias para detecção desses fungos, nos testes de sanidade com incubação direta da semente de milho. Neste sentido, os objetivos desta pesquisa foram: avaliar, em maiores detalhes, as relações do complexo Stenocarpella em associação com as sementes de milho; caracterizar por meio de técnicas moleculares os fungos S. macrospora e S. maydis e verificar a possibilidade do uso de marcadores moleculares e proteômicos como parte de testes diagnósticos destes fungos em sementes. Observou-se o efeito de cinco isolados de S. mcrospora sobre os híbridos de milho DKB-212 e DKB-333-B e o efeito dos cinco isolados de S. maydis sobre os híbridos de milho DKB-214 e DKB-333-B, inoculados em sementes. Observou-se que todos os isolados de S. macrospora aumentaram o índice de severdiade de doença (ISD) e afetaram a germinação, a emergência de plântulas, o índice de velocidade de emergência (IVE), a sobrevivência de plântulas e o peso de matéria seca da parte aérea (PMSA) e de raiz (PMSR). Todos os isolados de S. maydis, exceto um (May-43), proporcionaram o aumento do ISD das sementes dos híbridos DKB-214 e DKB-333-B inoculados, e afetaram negativamente a germinação, a sobrevivência de plântulas, o PMSA e o PMSR do híbrido DKB-333-B. Para as sementes do híbrido DKB-214, apenas dois isolados (May-57 e May-74) afetaram negativamente essas variáveis. A caracterização morfológica dos isolados de S. macrospora e de S. maydis foi determinada através do crescimento miceliano, o número de picnídios/cm2 em meio BDA, OA, EMA, CZA (meio Czapek), em dois regimes de temperatura, a 20oC e a 25oC. A caracterização molecular dos isolados de S. macrospora e de S. maydis foi realizada por meio do seqüenciamento dos produtos de PCR obtidos com oligonucleotídios desenhados para a região ITS do rDNA e para o gene da β-tubulina. Ambos os métodos foram eficientes na diferenciação dos isolados de S. macrospora e de S. maydis. Entretanto, não foi possível distinguir, com consistência, a origem geográfica dos isolados, a partir das análises de caracterização morfológica e molecular dos isolados de S. macrospora e S. maydis. Os produtos da digestão tríptica do extrato de proteína total obtidos de culturas puras de Drechslera maydis, S. maydis, S. macrospora, F. verticillioides e de sementes de milho inoculadas com S. maydis e S. macrospora, pela técnica de restrição hídrica (RH) por 72 horas foram analisadas por RP-HPLC. A análise em espectrômetro de massa Q-TOF foi realizada com os produtos da digestão tríptica do extrato protéico total de sementes de milho não inoculadas, das sementes inoculadas com S. maydis e com S. macrospora, pela técnica de restrição hídrica e o extrato miceliano de culturas puras de S. maydis, S. macrospora e F. verticillioides. Os dados obtidos por RP-HPLC revelaram diferenças nos perfis cromatográficos de culturas puras de ambos fungos, no tempo de retenção de 25 minutos. Entretanto, diferenças marcantes nos perfis cromatográficos obtidos de sementes inoculadas com os dois fitopatógenos, não foram identificadas por essa técnica. A análise discriminante realizada com base nos espectros MS, dos intervalos de 20 a 30 minutos e 50 a 60 minutos, obtidos das diferentes amostras estudadas revelaram que os fungos S. maydis e S. macrospora podem ser detectados diferencialmente em sementes de milho e também possibilitaram a distinção das diferentes espécies fúngicas analisadas. Desta forma, os dados obtidos neste trabalho, indicam que existe grande potencial de utilização da espectrometria de massa no desenvolvimento de novos métodos de detecção de fitopatógenos em sementes.The white ear rot disease of maize (Zea mays L.) caused by Stenocarpella macrospora (Earle( Sutton [Sin. D. macrospora Earle in Bull.] and Stenocarpella maydis (Berk.) Sutton [Sin. Diplodia maydis (Berk.) Sacc.; D. Zeae (Schw.) Lev.], is widely distributed in the hot and wet tropical regions occurring in areas where the crop is cultivated. Those pathogens are responsible by damages to seeds killing infected plants in flowering stage and causing significant losses in yield and affecting quality of grains. Stenocarpella species are also important microrganisms responsible for the production of mycotoxins. "Diplodiosis" is associated with the feeding of grain colonized by Stenocarpella species in poultry, lambs, and ruminants. The seed health testing, which includes incubation of seed, for detection of S. maydis and S. macrospora, normally requires fourteen days for getting the result, which is considered an excessive period of time. The objective this research was: to evaluate in details the relationship of Stenocarpella complex in maize seeds, to characterize S. macrospora and S. maydis and to verify the possibility of use proteomics markers to detect these fungi. In addition, the opportunity was taken to compare the effects of five isolates of S. mcrospor in maize seeds, breeding lines DKB-212 and DKB-333-B, as well as the effects of five isolates of S. maydis in maize seeds, lines DKB-214 and DKB-333-B. All isolates of S. macrospora were able to increase the rate of disease severity and to affect seed germination, seedling emergence rate (vigor), plant population, seedling survival, weight of dry matter of the aerial part and of the roots. All isolates of S. maydis, except one (May-43), were able to increase the rate of disease severity of the hybrids DKB-214 and DKB-333-B, and to affect the seed germination, seedling emergence rate (vigor), plant population and seedling survival, weight of dry matter of the aerial part and of the roots of the breding line DKB-333-B. For the line DKB-214, only two isolates affected negatively those variables. The mycelial growth was measured in Petri dishes containing potato-dextrose-agar (PDA), oat-agar (OA), corn extract, and Czapek medium in two temperatures, 20 oC and 25 oC. Evaluation was also made for number of pycnidia/cm2 and morphological characteristics of the conidia and pycnidia. The molecular characterization of S. macrospora and the S. maydis isolates was performed by PCR products obtained with primers for rDNA ITS region and for the β-tubulin gene. Both methods were efficient for differentiation of S. macrospora and S. maydis isolates. The results showed that no correlation was found between isolates of S. macropora and S. maydis and their geographical origins as detected by morphological and molecular traits. Trypitcal digestion products of total protein fractions obtained from pure cultures of S. maydis, S. macrospora, F. verticillioides, Drechslera maydis and maize seeds inoculated with S. maydis and S. macrospora with incubation for 72 hours, was analysed by RP-HPLC. For analysis by Q-TOF mass spectrometry (MS) a tryptical digestion products of total protein fraction obtained from control maize seeds and seeds inoculated with S. maydis and with S. macrospora and from mycelial extract of pure cultures of S. maydis, S. macrospora and F. verticillioides. The chromatography profiles from RP-HPLC of S. maydis and S. macrospora showed differences in 25 minutes of retention time. However, no differences could be detected between the RP-HPLC chromatograms of non inoculated and inoculated maize seeds with S. macrospora and S. maydis. Results of MS profiling at CapLC fractions collected at intervals of 20-30 and 50-60 minutes, showed that S. maydis and S. macrospora can be diferentialy detected in maize seeds and this methodology is also able to diferentiate the fungal species used in this study. Data obtained in this study indicate a great potential for mass spectrometry use in the development of new methods for seed-pathogen detection.UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRASDFP - Programa de Pós-graduaçãoUFLABRASILMachado, José da CruzResende, Mário Lúcio Vilela deAndrade, Alan CarvalhoVieira, Maria das Graças G. CarvalhoSouza, Ricardo Magela deFreitas, Marcos Augusto de2014-08-18T18:43:11Z2014-08-18T18:43:11Z2014-08-182006-02-24info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfFREITAS, M. A. de. Variabilidade, danos e detecção de Stenocarpella maydis e Stenocarpella macrospora em sementes de milho. 2006. 164 p. Tese (Doutorado em Agronomia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2006.http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/2903info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFLAinstname:Universidade Federal de Lavras (UFLA)instacron:UFLA2023-05-11T18:24:56Zoai:localhost:1/2903Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.ufla.br/oai/requestnivaldo@ufla.br || repositorio.biblioteca@ufla.bropendoar:2023-05-11T18:24:56Repositório Institucional da UFLA - Universidade Federal de Lavras (UFLA)false
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