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Andrea Mara MacedoSantuza Maria Ribeiro TeixeiraSantuza Maria Ribeiro TeixeiraVania Ferreira PradoEvanguedes KalapothakisAlvaro Jose RomanhaRenato Arruda MortaraSimone da Fonseca Pires2019-08-10T18:14:55Z2019-08-10T18:14:55Z2007-10-18http://hdl.handle.net/1843/UCSD-84XQK3Sistemas de transformação estável vêm sendo descritos para várias espécies de tripanosomatídeos como Leishmania spp, Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi . A transfecção pode ser mediada pela integração de genes exógenos no genoma da célula hospedeira, que ocorre por recombinação homóloga ou através da manutenção dosvetores transformados na forma episomal. Com o objetivo de gerar parasitos que expressassem proteínas fluorescentes de forma estável, formas epimstigotas do T. cruzi foram transfectadas com o vetor de expressão denominado pROCKGFP/RFPNeo, que leva a integração das proteínas verde (GFP) e vermelha (RFP) fluorescentes no loco de-tubulin via recombinação homóloga com esse loco. Clones dos parasitos transfectados foram obtidos por diluição seriada em placas de 96 poços e/ou placas de ágar-sangue. Foi avaliada a estabilidade na expressão de GFP e RFP entre as populações (parasitos não clonados) e os clones. Os parasitos foram cultivados por 1 e 2 meses na presença de G418 (200 e 400 g/mL) e na ausência da droga e em seguida analisados pela técnica de citometria de fluxo. Foi observado que os clones expressando GFP e RFP foram capazes de manter a porcentagem de parasitos fluorescentes na ausência do antibiótico,enquanto que nas populações, houve redução da porcentagem de células verdes e vermelhas fluorescentes. As análises de chromoblot mostraram a integração de GFP e RFP no loco de -tubulina. Os parasitos transfectados mostraram infectividade semelhante ao não transfectado em culturas de células Vero e a expressão das proteínasfluorescentes pôde ser facilmente visualizada nas três formas do ciclo de vida do parasito por microscopia confocal. Parasitos expressando GFP foram capazes de infectar camundongos GKO (interferon-gama knockout) e apresentaram alta parasitemia 12 dias após a infecção. Foram observados parasitos fluorescentes no coração e diafragma dos animais. Cultura de células co-infectadas com parasitos da cepa Tulahuén expressando as duas diferentes fluorescências, mostraram que dois parasitos diferentes podem infectar a mesma célula. Também foram observadas células co-infectadas com parasitos transfectados, derivados de cepas pertencentes às distintas linhagens de T. cruzi, Col1.7G2GFP (T. cruzi I) e TulahuénRFP (T. cruzi II). Os parasitos gerados expressando GFP e RFP constituem, portanto uma nova ferramenta para o estudo de vários aspectos da biologia do T. cruzi. Com eles podemos estudar mecanismos de invasão celular, troca genética, susceptibilidade às drogas e inúmeros aspectos dainteração parasito-hospedeiro invertebrado e vertebrado, neste último, enfatizando o modelo histotrópico-clonal da doença de Chagas em modelos animais.Stable transfection protocols have been described for a number of protozoan parasites such as Leishmania spp, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi. The transfection can be achieved by the integration of the foreign gene into the genome through homologous recombination, or by episomal maintenance of the transfected plasmid. In order to produce parasites expressing fluorescent proteins, epimastigotes forms of T.cruzi were transfected with the plasmid pROCKGFP/RFPNeo. This construction allowed the integration of green (GFP) and red (RFP) fluorescent protein genes by homologous recombination into -tubulin locus of several strains of the parasite. Parasites transfected clones were isolated by serial dilution and/or agar-blood plates. To evaluate the stability of the GFP and RFP markers in the transfected populations andclones, parasites were cultivated for 1 and 2 months in the absence or presence of G418 (200 g mL and 400 g mL) and were analyzed by FACS. The selected clones were able to maintain high expression levels of the fluorescent protein markers even in absence of G418, whereas in transfected population, expression of GFP and RFP markers wassignificantly reduced when cultured in the absence of the drug. The integration of the GFP and RFP markers in the tubulin locus was confirmed by chromoblot analyses. GFP and RFP expressing parasites were inoculated into Vero cells culture to evaluate the infectivity of the transfected population. When compared with the wild type population, no significant differences in the infectivity of Vero cells were found. Wedetected the fluorescent proteins in the tree forms of parasite life cicle by confocal and fluorescence microscopy. Furthermore, GFP expressing parasites were able produce significant levels of parasitemia 12 days after being inoculated into interferon-gamma knockout (GKO) mice. We observed fluorescent parasites in heart and diaphragm of infected animals. Cell cultures infected simultaneously with two cloned cell lines, each one expressing a distinct fluorescent marker, showed that two different parasites were able to infect the same cell. Double infected cells were also detected when GFP and RFP expressing parasites are derived from strains belonging to two distinct T. cruzi lineages Col1.7G2GFP (T. cruzi I) and TulahuénRFP (T. cruzi II). The parasites expressing GFP and RFP constitute a new tool for the study of various aspects of the T.cruzi biology. We can study the cellular invasion mechanism, genetic exchange, drug susceptibility and several aspects of interaction with invertebrate and vertebrate hosts, emphasizing the histotropic-clonal model of Chagas disease.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGBioquímicaBioquimicaGeração e caracterização de linhagens de Trypanosoma cruzi expressando proteínas fluorescentes como ferramentas para pesquisa em Doença de Chagasinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALtese_simonepires.pdfapplication/pdf12898887https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/UCSD-84XQK3/1/tese_simonepires.pdf5c5195b36a1685f22568abcc3ea2ec84MD51anexo1_darocha_2004.pdfapplication/pdf1077406https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/UCSD-84XQK3/2/anexo1_darocha_2004.pdf160baec590150b2986b7a658fcb593bcMD52anexo2_pires_2008.pdfapplication/pdf785683https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/UCSD-84XQK3/3/anexo2_pires_2008.pdf72c3852f19b9dd8d1c2497112915e0b1MD53TEXTtese_simonepires.pdf.txttese_simonepires.pdf.txtExtracted texttext/plain209495https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/UCSD-84XQK3/4/tese_simonepires.pdf.txt5f36bde1287fbd1e53a3237d5dcf9299MD54anexo1_darocha_2004.pdf.txtanexo1_darocha_2004.pdf.txtExtracted texttext/plain39097https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/UCSD-84XQK3/5/anexo1_darocha_2004.pdf.txtaf1a9255ff0be4cd454b1d55287cb591MD55anexo2_pires_2008.pdf.txtanexo2_pires_2008.pdf.txtExtracted texttext/plain43419https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/UCSD-84XQK3/6/anexo2_pires_2008.pdf.txtb7da21a18911b2c66ca44e61df166b07MD561843/UCSD-84XQK32019-11-14 05:49:46.597oai:repositorio.ufmg.br:1843/UCSD-84XQK3Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T08:49:46Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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