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Claudio Antonio BonjardimLuciana Garcia Andrade2019-08-10T23:43:07Z2019-08-10T23:43:07Z2012-03-06http://hdl.handle.net/1843/BUOS-AP8MFBA multiplicação viral eficiente resulta de uma complexa rede de interações vírus - célula hospedeira, que gera um ambiente intracelular propício a geração e disseminação da progênie viral. Interferir em vias de sinalização relacionadas à dinâmica do citoesqueleto é uma estratégia comum empregada pelos vírus para atingir esse propósito. O Orthopoxvirus Vaccinia (VACV), membro protótipo da família Poxviridae, interage de forma complexa com o citoesqueleto de actina e de microtúbulos de suas células hospedeiras durante seu ciclo de multiplicação viral, sendo esta manipulação essencial para garantir a eficiência da penetração, montagem, transporte e disseminação viral. Neste trabalho tivemos como objetivo investigar o papel desempenhado pela serina/treonina cinase PAK1 (p21-activated kinase 1) na infecção pelo VACV. Para isso, fibroblastos embrionários murinos (MEFs) derivados de camundongos selvagens (WT) ou nocautes (PAK1-/-) para PAK1, foram infectados com VACV por diferentes períodos de tempo. Verificou-se, através de ensaios de transferência de Western e microscopia de fluorescência, que PAK1 não está criticamente envolvida em etapas precoces do ciclo de multiplicação do VACV, sendo que a necessidade de PAK1 para a penetração do VACV por macropinocitose, previamente descrita (Science, 320:531, 2008), não interfere com a produção viral. Apesar disso, observamos que a ausência de PAK1 provoca uma grande redução no tamanho da placa viral, e que infecções a baixa MOI resultam em uma produção significativamente menor (~ 90%), tanto de IMVs, quanto de EEVs, indicando que a disseminação viral está sendo de alguma forma prejudicada. Marcação fluorescente do citoesqueleto de actina e microscopia eletrônica de varredura mostraram uma redução no número de caudas de actina induzidas pelo VACV em MEFs PAK1-/- sem haver, no entanto, alteração da quantidade de CEVs expostos na superfície celular. Além disso, experimentos de microscopia confocal revelaram que a ausência de PAK1 não impede o recrutamento do complexo ARP2/3 para os sítios de polimerização de actina subjacentes aos CEVs, e que em células WT, a forma ativa de PAK1 (P-PAK1 Thr 423) colocaliza com CEVs e caudas de actina. Assim, os resultados obtidos permitem concluir que PAK1 desempenha um papel na disseminação viral, sendo um constituinte celular importante para garantir a eficiência desse processo.An efficient virus multiplication cycle results from a complex network of virus-host interactions culminating with a propitious intracellular environment for the generation and spread of virus progeny. Interfering with signaling pathways related to cytoskeleton dynamics is a common strategy employed by viruses to achieve this purpose. The Orthopoxvirus Vaccinia (VACV), the prototypic member of Poxviridae family, interacts in a complex way with both actin and microtubules cytoskeleton of their host cells during the whole replication cycle, and this manipulation is essential to assure the efficiency of viral entry, assembly, transport and dissemination. In the present study we investigated the possible involvement of serine/threonine kinase PAK1 (p21-activated kinase 1) upon VACV infection. To that end, mouse embryo fibroblasts (MEFs) derived from wild-type (WT) and PAK1-null (PAK1-/-) mice were infected with VACV at different times. We showed, through Western blotting assay and fluorescence microscopy, that PAK1 is not critically involved in the early steps of VACV cycle, and the need of PAK1 to VACV entry by macropinocytosis, previously described (Science, 320:531, 2008), does not affect the production of intracellular mature virus (IMVs). Although, we found that the absence of PAK1 led to a severe reduction in plaque phenotype and infections of MEFs PAK1-/- carried out at low-multiplicity were followed by a greatly reduced production (~90%) of both IMV and extracellular enveloped virus (EEV), indicating that virus spread was drastically impaired. Immunofluorescent staining of actin cytoskeleton and scanning electron microscopy showed a reduction in the number of VACV-induced actin tails in MEFs PAK1-/-, without alteration in the amount of cell-associated enveloped virus (CEVs). Furthermore, confocal microscopy of MEFs PAK1+/+ infected with VACV reveled a colocalization of P-PAK1 with actin tails tips as well as CEVs (B5R) particles. Indeed, these results show that PAK1 plays a role in actin-based motility of VACV, being an important cellular constituent to assure the efficiency of viral dissemination.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGMicrobiologiaVirologiaPoxvírusCreatina quinaseVaciniaPAK1Disseminação viralVaccinia VirusInteração vírus-hospedeiroO envolvimento da proteína cinase PAK1 na infecção pelo Orthopoxvirus vaccinia: implicações para a disseminação viralinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALtese___luciana_garcia_andrade.pdfapplication/pdf3001649https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-AP8MFB/1/tese___luciana_garcia_andrade.pdf07ab375707c14ff33676f3fa3f8580d2MD51TEXTtese___luciana_garcia_andrade.pdf.txttese___luciana_garcia_andrade.pdf.txtExtracted texttext/plain190467https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-AP8MFB/2/tese___luciana_garcia_andrade.pdf.txt86aa35680c61c8b283ee8ffcef0518c9MD521843/BUOS-AP8MFB2019-11-14 04:13:39.011oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUOS-AP8MFBRepositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T07:13:39Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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