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Christopher Kushmerickhttp://lattes.cnpq.br/6998917765406696Ricardo Mauricio Xavier LeãoCélio José de Catro JúniorGrace Scheanatto Pereira Moraeshttp://lattes.cnpq.br/7119586646644762Éverton dos Santos e Alhadas2023-08-22T14:23:32Z2023-08-22T14:23:32Z2019-02-20http://hdl.handle.net/1843/58056Receptores metabotrópicos para glutamato (mGluR) são receptores acoplados a proteína G amplamente distribuídos no sistema nervoso central. Em trabalho anterior, utilizando registros intracelulares, mostrei que a ativação de receptores mGluR do Grupo I altera, de forma rápida e reversível, a excitabilidade de neurônios do núcleo medial do corpo trapezoide (MNTB). Especificamente, o tratamento com o agonista seletivo, S-3,5 dihidroxyfenylglycerol (DHPG, 100 µM), despolariza os neurônios, aumenta a resistência de membrana, reduz a reobase e aumenta o número de potencias de ação por uma dada intensidade de corrente injetada. No presente trabalho, procuramos avaliar os mecanismos responsáveis por esses efeitos e as consequências funcionais para o desempenho da sinapse. Para tal, realizamos registros de potencial de membrana e da corrente de membrana utilizando a técnica de patch clamp na modalidade whole cell. Assim como foi observado utilizando registros intracelulares, utilizando a técnica de whole-cell o DHPG (10-100 µM) despolarizou os neurônios do MNTB, por 7.2±1 mV (N=10). Sob voltage clamp (Vm = -60 mV), DHPG gerou uma corrente de entrada de -70 ± 8 pA (N=10), e ao mesmo tempo aumentou a resistência da membrana. A corrente gerada pelo DHPG foi significativamente reduzida quando medida na presença de MPEP, um antagonista da isoforma mGlu5. Porém, cerca de 60% da corrente gerada pela DHPG foi insensível ao MPEP, sugerindo a participação do receptor mGlu1. O pré-tratamento conjunto com MPEP e LY367685 (antagonista mGlu1) aboliu o efeito de DHPG (N=4), demonstrando ação clara do agonista, DHPG, agindo sobre receptores mGluR-I em neurônios do MNTB. O uso de outros antagonistas seletivos permitiu descartar a participação de receptores iGluRs (NMDA, AMPA e Cainato) e canais NaV no efeito promovido pela ativação dos receptores metabotrópicos do Grupo I. Para melhor explorar a natureza da corrente gerada pelo DHPG, aplicamos protocolos de voltage clamp em formato de rampas que se estendiam de -120 mV a -30 mV e permitiam medir a relação corrente-voltagem (I-V) nesse faixa de potencial. Pela subtração digital das curvas medidas na presença de DHPG e das curvas medidas em controle, a dependência de voltagem da corrente ativada por DHPG foi calculada. Tal análise revelou uma corrente negativa, que tende para zero em potenciais perto do potencial de equilíbrio de K+. Juntos, esses dados sugerem que a corrente gerada pelo DHPG, que se manifesta como uma corrente de entrada, na realidade se dá pela inibição de uma corrente de saída por um canal para K+. O presente estudo indica, ainda, que a injeção de corrente positiva mimetiza o efeito da aplicação de DHPG levando a conclusão de que o principal efeito da ativação dos receptores mGluR-I nos potenciais de ação émediado pela despolarização da membrana. Para avaliarmos as consequências funcionais da ativação de receptores mGluR-I, estimulamos a fibra aferente que forma a sinapse glutamatérgica cálice de Held e medimos os EPSPs e APs gerados no neurônio do MNTB. Quando estimulado na taxa de 100 Hz (duração do estimulo 1 s), houve depressão do tamanho do EPSP e falhas pós-sinápticas (i.e., a geração de EPSPs cujas amplitudes foram insuficientes para gerar um PA). A análise dos resultados revelou uma nítida redução das falhas pós-sinápticas na presença de DHPG quando comparado com a condição controle, medida na mesma célula. Essa diferença não foi por alterações na plasticidade sináptica porque nem a facilitação nem a depressão foram significantemente alteradas. Os achados sugerem que a ativação dos mGluR do Grupo I aumenta a probabilidade de EPSPs de mesma amplitude desencadearem potenciais de ação. Concluímos que as alterações na excitabilidade intrínseca, ocasionada pela ativação de receptores mGluR-I, resultam em importantes consequências para a robustez da neurotransmissão em alta frequência no MNTB, que é uma característica dessa sinapse.Metabotropic glutamate receptors (mGluR) are G protein-coupled receptors widely distributed in the central nervous system. In previous work, using intracellular registers, I showed that the activation of mGluR receptors rapidly and reversibly alters the excitability of neurons in the medial nucleus of the trapezoid body (MNTB). Specifically, treatment with the selective agonist, DHPG (100 μM), depolarizes the neurons, increases membrane resistance, reduces reobase, and increases the number of action potentials by a given intensity of injected current. In the present work, we try to evaluate the mechanisms responsible for these effects and the functional consequences for the synapse performance. For this, we performed membrane and membrane current potential records using the patch clamp technique in the whole cell mode. As observed using intracellular registries, using the whole-cell technique DHPG (10-100 μM) depolarized the MNTB neurons by 7.2 ± 1 mV (N = 10). Under voltage clamp (Vm = 60 mV), DHPG generated an input current of -70 ± 8 pA (N = 10), and at the same time increased membrane resistance. The current generated by DHPG was significantly reduced when measured in the presence of MPEP. However, about 60% of the current generated by DHPG was insensitive to MPEP (mGlu5), suggesting the participation of the mGlu1 receptor. Pre-treatment with MPEP and LY367685 (mGlu1) abolished the effect of DHPG (N=4), demonstrating clear agonist action, DHPG, acting on mGluR-I receptors on MNTB neurons. The use of antagonists allowed to discard the participation of iGluRs receptors (NMDA, AMPA and Kainate) and NaV channels in the effect promoted by the activation of Group I metabotropic receptors. To better explore the nature of the current generated by DHPG, we applied voltage clamp protocols in the form of ramps that extended from -120 mV to -30 mV and allowed to measure the current-voltage (IV) relation in this potential range. By the digital subtraction of the curves measured in the presence of DHPG and the curves measured in control, the voltage dependence of the DHPG activated current was calculated. Such analysis revealed a negative current, which tends to zero at potentials near the equilibrium potential of K+. Together, these data suggest that the current generated by DHPG, which manifests itself as an input current, actually occurs by inhibiting an output current through a channel for K+. The present study also indicates that positive current injection mimics the effect of DHPG application leading to the conclusion that the main effect of the activation of mGluR-I receptors on action potentials is mediated by membrane depolarization. To evaluate the functional consequences of the activation of mGluR-I receptor, we stimulated the afferent fiber forming the glutamatergic synapse Calyx of Held and measured the EPSPs and APs generated in the MNTB neuron. Whenstimulated at the rate of 100 Hz (duration of the stimulus 1 s), there was depression of the EPSP size and post-synaptic failures (i.e., generation of EPSPs whose amplitudes were insufficient to generate a PA). Analysis of the results revealed a clear reduction of postsynaptic failures in the presence of DHPG when compared to the control condition, measured in the same cell. This difference was not due to changes in synaptic plasticity because neither facilitation nor depression were significantly altered. The findings suggest that the activation of Group I mGluR increases the chance of EPSPs of the same amplitude triggering post-synaptic action potentials. We conclude that the changes in intrinsic excitability caused by the activation of mGluR-I receptors result in important consequences for the robustness of high-frequency neurotransmission, which is a characteristic of this synapse.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorporUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e FarmacologiaUFMGBrasilICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAShttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/info:eu-repo/semantics/openAccessFisiologiaAparelho auditivoCorpo TrapezoideReceptores de Glutamato MetabotrópicoMNTBWhole-cell Patch clampReceptor Metabotrópico GlutamatérgicoDHPGImGluR-Potencial de açãoModulação excitatória das células principais do núcleo medial do corpo trapezoide por receptores metabotrópicos glutamatérgicos do Grupo Iinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALTese - Éverton dos Santos e Alhadas - Trabalho completo.pdfTese - Éverton dos Santos e Alhadas - Trabalho completo.pdfapplication/pdf1615064https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/58056/1/Tese%20-%20%c3%89verton%20dos%20Santos%20e%20Alhadas%20-%20Trabalho%20completo.pdf0f43ec536cc8e5e8e6d068187ad98d54MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/58056/2/license_rdfcfd6801dba008cb6adbd9838b81582abMD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82118https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/58056/3/license.txtcda590c95a0b51b4d15f60c9642ca272MD531843/580562023-08-22 11:23:32.91oai:repositorio.ufmg.br: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2023-08-22T14:23:32Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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