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Evelyn de Souza OliveiraCarlos Augusto RosaCésar Simões da FonsecaCarlos Augusto RosaCibele Tosin StroppaIeso de Miranda CastroSilvio Silvério da SilvaRoberto Goncalves JunqueiraCarla Alves Lara2019-08-10T19:29:00Z2019-08-10T19:29:00Z2013-12-06http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9XTHECA exploração da diversidade microbiana permite a descoberta de novas fontes de enzimas com potencial aplicação na indústria biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi selecionar e caracterizar enzimas xilanolíticas produzidas por leveduras e fungos leveduriformes e avaliar sua aplicabilidade em alguns processos biotecnológicos. Na primeira parte deste estudo, isolados de leveduras associadas à madeira e ao bagaço de cana-de-açúcar em decomposição foram investigados quanto a sua capacidade de produzir enzimas xilanolíticas. Vinte e um isolados de leveduras, que apresentaram atividade de xilanase em meio sólido contendo xilana Beechwood, foram cultivados em meio líquido, e os cinco isolados que apresentaram maior atividade xilanolítica foram caracterizados quanto à atividade de xilanase e -xilosidase em dois substratos indutores: xilana e D-xilose. A xilana foi o melhor indutor de atividade de xilanase (medida a 50°C) em Cryptococcus laurentii UFMG-HB-48, Scheffersomyces shehatae UFMG-HM-9.1a e Sugyiamaella smithiae UFMG-HM-80.1 (1,16, 0,69 e 0,50 U mL-1, respectivamente). A maior atividade específica (11,05 U mg-1) foi obtida pelo Cr. laurentii UFMG-HB-48 a 50°C usando xilana como indutor. A maior atividade extracelular de -xilosidase foi encontrada, com indução por xilana, em Su. smithiae UFMG-HM-80.1 (0.76 U mL-1). Com indução por xilose, a maior atividade intracelular de -xilosidase foi detectada em Cr. laurentii UFMG-HB-48 a 50°C e, quando medida a 30°C, a maior atividade intracelular de -xilosidase foi encontrada em Candida tropicalis UFMG-HB-93a. Este estudo identificou um conjunto de leveduras com capacidade de hidrolisar a xilana, revelando as estratégias metabólicas para a assimilação dos seus produtos de degradação (xilo-oligossacarídeos e xilose). Neste trabalho, o fungo leveduriforme Aureobasidium pullulans foi usado como referência para os ensaios enzimáticos, por ser conhecido como uma fonte de enzimas xilanolíticas com alta atividade específica. Verificou-se que a linhagem A. pullulans UFMG-Bro-53 caracteriza-se por apresentar uma maior atividade volumétrica a 30°C semelhante à obtida a 50ºC (21,7 U mL-1) e cerca de três vezes superior à obtida a 30ºC em A. pullulans Y-2311, uma linhagem bem caracterizada na literatura. As atividades de xilanases obtidas com A. pullulans UFMG-Bro-53 foram significativamente superiores às obtidas com as leveduras identificadas neste trabalho. Quando induzido por xilana, o extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 apresentou atividade xilanase máxima a uma temperatura de 40°C e pH na faixa 4,0-5,0. A fração mais abundante do extrato possui massa molecular aparente de 22 kDa. Entre frações purificadas com atividade de xilanase, esta apresenta uma atividade ótima a uma temperatura de 40°C e a pH 4,0-5,0. O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 apresentou especificidade xilanolítica, sem demonstrar atividade celulase ou protease. Por isso, este extrato foi aplicado em processos biotecnológicos, como a hidrólise de hemicelulose (xilana) em material lignocelulósico e em processos de panificação. O extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 foi avaliado na hidrólise de xilana e de palha de trigo pré-tratada hidrotermicamente, e na atuação em sacarificação e fermentação simultânea (SSF) na produção de etanol lignocelulósico. O extrato mostrou ser mais eficiente na hidrólise de xilana e palha de trigo por comparação com a hemicelulase comercial HTec2, gerando concentrações de D-xilose que chegaram a cinco vezes superiores com palha de trigo a 10% (p/v) de conteúdo em sólidos. Quando usado na suplementação da celulase comercial CTec2 atingiu um rendimento de hidrólise enzimática mais elevado do que CTec2 sem suplementação. Nos experimentos de SSF, a 35ºC, usando xilana Beechwood como substrato e a levedura fermentadora de xilose Spathaspora passalidarum UFMG-HMD1.1, o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 atuou eficientemente na degradação de xilana à xilose com um rendimento maior (estimado em 66%) em relação à hidrólise realizada separadamente (apenas 16%) atingindo uma concentração de etanol de 6,6 g L-1, correspondente a um rendimento de 0,2 g g-1. Quando comparado com uma levedura Saccharomyces cerevisiae comercial (Ethanol Red), capaz de fermentar apenas a fração de hexoses, a levedura S. passalidarum UFMG-HMD1.1, fermentadora de hexoses e pentoses, promoveu uma melhoria no rendimento de conversão da palha de trigo a etanol com a suplementação com o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53, uma vez que as xilanases do extrato disponibilizaram mais xilose que, por sua vez, pôde ser fermentada por S. passalidarum. A utilização das enzimas xilanolíticas presentes no extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 foi ainda analisada em processo de panificação. Na dose de 120 U (xilanase) kg-1 de farinha de uma mistura de panificação para a produção de pão de forma, conduziu a um aumento no volume e uma redução da firmeza do miolo, em relação ao controle negativo, sem adição de enzimas, mas atingindo valores semelhantes aos obtidos com a xilanase comercial Spring Mono, uma glicosil hidrolase da família GH11. No entanto, para doses superiores a 120 U kg-1 de farinha, o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 parece ter um efeito negativo nas propriedades do pão, o que parece estar associado ao fato do extrato conter xilanases da família GH10, que não possui eficiência na panificação, quando comparado com outras contidas no extrato como as da família GH11.The exploration of microbial diversity enables the discovery of new sources of enzymes with potential application in the biotechnology industry. The aim of this work was to select and characterize xylanolytic enzymes - produced by yeasts - and evaluate their applicability in biotechnological processes. In the first part of this study, yeast isolates associated to rotting wood and sugarcane bagasse were investigated for their ability to produce xylanolytic enzymes. Twenty-one yeast isolates showing xylanolytic activity on solid medium containing Beechwood xylan were grown in liquid medium, and the five isolates presenting the highest xylanolytic activity were characterized regarding the xylanase and -xylosidase activities using two inducing substrates: xylan and D -xylose. Xylan was the best inducer of xylanase activity (measured at 50°C) in Cryptococcus laurentii UFMG-HB-48, Scheffersomyces shehatae UFMG-HM-9.1a and Sugyiamaella smithiae UFMG-HM-80.1 (1.16, 0.69 and 0.50 U mL-1, respectively). The highest specific activity (11.05 U mg-1) was obtained by Cr. laurentii UFMG-HB-48 at 50°C using xylan as inducer. The highest level of extracellular -xylosidase activity found was induced by xylan in Su. smithiae UFMG-HM-80.1 (0.76 U mL-1). Upon induction of D-xylose, the highest level of intracellular -xylosidase activity was detected by Cr. laurentii UFMG-HB-48 at 50°C, and, when measured at 30°C, the highest intracellular -xylosidase activity was found by Candida tropicalis UFMG-HB-93a. This study identified a set of yeasts with xylan-hydrolyzing capacity, revealing the metabolic strategies for the assimilation of their degradation products (xylo- oligosaccharides and xylose). In this work, the yeast-like fungus Aureobasidium pullulans, known as a source of xylanolytic enzymes with high specific activity, has been used as a reference for the enzymatic assays. It was found that the strain A. pullulans UFMG-Bro-53 showed higher volumetric activity at 30°C, similar to that obtained at 50°C (21.7 U mL-1) and three times greater than the activity obtained at 30°C by A. pullulans Y-2311, a strain well characterized in the literature. The xylanolytic activities obtained with A. pullulans UFMG-Bro-53 were significantly higher than those obtained with the yeasts previously identified in this work. Therefore, this strain (A. pullulans UFMG-Bro-53) was further studied, particularly in the characterization of its xylanolytic potential. When induced by xylan, the extracellular extract of this strain showed a maximum xylanase activity at 40°C and pH 4.0-5.0. The most abundant fraction of the extract has an apparent molecular mass of 22kDa. Among the purified fractions showing xylanase activity, this fraction shows an optimal activity at 40°C and pH 4.0-5.0. The extracellular extract of A. pullulans UFMG-Bro-53 showed xylanolytic specificity without cellulase or protease activities. Thus, this extract has been used in biotechnological processes, as in the hydrolysis of hemicellulose (xylan) in lignocellulosic materials and baking processes. The extracellular extract of A. pullulans UFMG-Bro-53 was evaluated in the hydrolysis of xylan and pretreated wheat straw and in simultaneous saccharification and fermentation (SSF) for the production of lignocellulosic ethanol. The extract was more efficient in the hydrolysis of xylan and wheat straw when compared to the commercial hemicellulase HTec2, generating D-xylose yields five times higher with wheat straw at 10% solids content. When used in supplementation of the commercial cellulase CTec2, it reached a higher enzymatic hydrolysis yield than when using CTec2 without supplementation. In SSF experiments, at 35°C, using Beechwood xylan as substrate and yeast strain S. passalidarum UFMG-HMD-1.1, XBro extract acted efficiently in the degradation of xylan to xylose with a higher yield (estimated at 66%) compared to the hydrolysis performed separately (16%), reaching an ethanol concentration of 6.6 g L-1,corresponding to 0.2 g g-1 ethanol yield. When compared with the commercial hexose-fermenting yeast Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), Spathaspora passalidarum UFMG-HMD-1.1, a hexose and pentose-fermenting yeast, promoted an improvement in the conversion yield of wheat straw into ethanol when supplemented with the XBro extract, once the xylanases present in the extract provided more xylose, which, in turn, could be fermented by S. passalidarum. The use of xylanolytic enzymes present in the extracellular extract of A. pullulans UFMG -Bro -53 was further analyzed in a baking process. In a dosage of 120 U (xylanase) kg-1 of flour of a baking mixture for bun production, it led to an increase in volume and a reduction in crumb firmness of bread, when compared to the negative control, i.e. without addition of enzymes, but reaching similar values to those obtained with the commercial xylanase Spring Mono, a glycoside hydrolase from family GH11. However, at dosages higher than 120 U kg-1 of flour, the extract appears to have a negative effect in bread properties, which seems to be associated with the fact that this extract contains family GH10 xylanases, in addition to family GH11 xylanases.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGBiotecnologia microbianaLeveduras (Fungos)Panificação MicrobiologiaBioetanolXilanasesEtanol lignocelulósicoLeveduras xilanolíticasAureobasidium pullulansAplicações biotecnológicas de xilanasesXilanasesHidrólise de xilanaPanificaçãoXilanases de leveduras e fungos leveduriformes e sua aplicação em processos de produção de bioetanol lignocelulósico e panificaçãoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALlarac_xilanases_de_leveduras_e_fungos_leveduriformes_e_sua_aplica__o_em__processos_de_produ__o_de_bioetanol_lignocelul_sic_1.pdfapplication/pdf3258349https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUBD-9XTHEC/1/larac_xilanases_de_leveduras_e_fungos_leveduriformes_e_sua_aplica__o_em__processos_de_produ__o_de_bioetanol_lignocelul_sic_1.pdf47b94c09e1de74f7afbfed9e32f6c3a6MD51TEXTlarac_xilanases_de_leveduras_e_fungos_leveduriformes_e_sua_aplica__o_em__processos_de_produ__o_de_bioetanol_lignocelul_sic_1.pdf.txtlarac_xilanases_de_leveduras_e_fungos_leveduriformes_e_sua_aplica__o_em__processos_de_produ__o_de_bioetanol_lignocelul_sic_1.pdf.txtExtracted texttext/plain305767https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUBD-9XTHEC/2/larac_xilanases_de_leveduras_e_fungos_leveduriformes_e_sua_aplica__o_em__processos_de_produ__o_de_bioetanol_lignocelul_sic_1.pdf.txtadd9948ef607fb24aad587da5fbb741eMD521843/BUBD-9XTHEC2019-11-14 10:36:55.228oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUBD-9XTHECRepositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T13:36:55Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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