Análise global do transcriptoma de pequenos RNAs e RNAs mensageiros durante a Interação Macrófago -Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: André Nicolau Aquime Gonçalves
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-B97EXG
• topic: Bioinformática; Trypanosoma cruz; MicroRNAs; Genes; Bioinformática; Sequência de Bases

A doença de Chagas é causada pelo parasito intracelular Trypanosoma cruzi, que é capaz de infectar vários tipos celulares. A interação inicial entre parasito e hospedeiro envolve a ativação de vias responsáveis pela internalização do parasito, resposta imune inata do hospedeiro e o combate aos parasitos intracelulares. Diversas mudanças na expressão gênica acontecem na célula hospedeira em resposta ao patógeno e vice-versa. As vias de RNA de interferência (RNAi) estão relacionadas à regulação pós-transcricional da expressão gênica mediada por pequenos RNAs não codificantes como os microRNAs (miRNAs), que permitem um ajuste fino de várias respostas biológicas e são alteradas em infecções parasitárias. Macrófagos infectados por Leishmania sp. ou Toxoplasma sp. tem a expressão alterada de miRNAs que regulam a resposta à estes parasitos. Até o momento, não há descrição do papel de miRNAs durante a infeção do Trypanosoma cruzi em macrófagos murinos. Neste trabalho, realizamos o sequenciamento de pequenos RNAs de macrófagos murinos infectados com o parasito Trypanosoma cruzi nos tempos de 2, 4, 8 e 48 horas após infeção, para avaliar a expressão geral do transcriptoma de pequenos RNAs, especialmente os miRNAs do hospedeiro. A expressão da citocina pro-inflamatória TNF- foi avaliada como indicador da resposta imune inata durante a infeção, bem como o crescimento dos parasitos intracelulares. Não houve mudanças qualitativas no perfil de pequenos RNAs derivados do genoma do parasito ao longo da infeção. Em contraste, entre os pequenos RNAs do hospedeiro, observamos a expressão diferencial de vários miRNAs entre os tempos de 2 e 48 horas. Dos 18 miRNAs que apresentaram expressão diferencial em algum tempo da infeção, somente 1 foi expresso positivamente em pelo menos dois tempos analisados, o miR-34c-5p. Identificamos pela ferramenta TargetScan e pela base de dados StarBase, alvos preditos e validados para os miRNAs diferencialmente expressos e utilizamos os alvos encontrados em ambos para o estudo das funções dos miRNAs. A análise de enriquecimento dos mRNAs alvos para vias biológicas sugerem que os miRNAs estão relacionados com vias como, sinalização de TGF-, atividade transcricional das Smads, cascata de sinalização de PI3K, sinalização de morte celular via JNK bem como a ativação de NFKB via TRAF6. O miR-34c-5p mostrou regulação positiva significativa ao longo da infeção e validamos a expressão por RT-qPCR. A análise dos mRNAs alvos do miR-34c-5p mostrou enriquecimento para processos biológicos como resposta de apoptose e sinalização por Notch. Como os miRNAs agem através da regulação da estabilidade de seus mRNAs alvos, o transcriptoma dos macrófagos após 4 e 8 horas de infeção foi sequenciado e analisado. Ao todo, 274 mRNAs foram regulados: 33 foram regulados negativamente e 241 foram regulados positivamente em algum dos tempos analisados. Entretanto, não houve nenhuma correlação direta, positiva ou negativa, entre os alvos dos miRNAs diferencialmente expressos durante a infeção e sua expressão no transcriptoma. Apesar disto, nós observamos a intersecção de vias biológicas enriquecidas para os mRNAs alvos dos miRNAs diferencialmente expressos e vias biológicas enriquecidas para os mRNAs diferencialmente expressos no transcriptoma. As vias biológicas enriquecidas foram, sinalização de Rho GTPases, transporte de membrana, controle do ciclo celular, sinalização por Notch e transporte e modificação pelo complexo de Golgi. Assim, os miRNAs induzidos pela infeção do T. cruzi em macrófagos estão, provavelmente, envolvidos no ajuste fino de atividades das vias biológicas importantes na resposta à infeção, podendo atuar como reguladores indiretos dos componentes dessas vias. Como perspectiva futura, os miRNAs diferencialmente expressos serão bloqueados e avaliados o seu impacto na reposta à infeção pelo T. cruzi em macrófagos murinos.