Desenvolvimento de métodos moleculares e sorológicos para diagnóstico específico de infecções por Leishmania (Leishmania) amazonensis
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Data de Publicação: | 2019 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFMG |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/1843/35441 |
Resumo: | A ampla distribuição e sobreposição de espécies de Leishmania e de diferentes formas clínicas das leishmanioses no país podem afetar diretamente o curso clínico da doença, diagnóstico, controle e tratamento. Com isso, o desenvolvimento de métodos de diagnóstico espécie-específicos e que possam ser utilizados na rotina são necessários e de grande importância. No Brasil, a espécie Leishmania amazonensis é agente etiológico principalmente da forma cutânea da doença, mas já foi também encontrada promovendo doença visceral em humanos e cães. Além disso, sua coexistência com outras espécies do parasito, como L. infantum, agente etiológico da leishmaniose visceral, torna de suma importância a identificação da espécie durante o diagnóstico da infecção por Leishmania spp. Para isso, no presente trabalho, como teste molecular, padronizamos a técnica de LAMP (Amplificação Isotérmica Mediada por Loop), a partir do desenho e utilização de iniciadores específicos para L. amazonensis com visualização do resultado utilizando gel de poliacrilamida e detecção colorimétrica (SYBR® Safe). A reação apresentou 100% de especificidade quando comparado as espécies L. infantum, L. braziliensis, L. major, L. mexicana, L. donovani, L. guyanensis, Trypanosoma cruzi, Babesia canis e Toxoplasma gondii e quando testado diferentes cepas de L. amazonensis. O limite de detecção da reação foi de 10pg de DNA de L. amazonensis. Apresentou 89% de sensibilidade quando comparada a PCR convencional utilizando amostras de DNA de pele de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis (n=9), L. infantum (n=9) e coinfecção (n=9). Para o desenvolvimento de um teste sorológico, foi realizada uma abordagem imunoproteômica para seleção de proteínas antigênicas espécie-específicas, para isso, utilizamos extrato proteico de L. amazonensis fracionados em eletroforese bi-dimensional (2-DE) associados a western blot (WB) com pool de soros de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis e L. infantum. A sobreposição entre as imagens de gel 2-DE e membranas de WB permitiu a seleção de 8 spots reativos somente a soros de animais infectados com L. amazonensis e não reativos a soros de infectados com L. infantum ou de não infectados. Foram identificadas duas proteínas em 6/8 spots. Uma delas, a HSP70, produzida de forma recombinante foi utilizada como antígeno em um teste de ELISA com pool de soros de hamsters infectados com L. amazonensis, L. infantum, coinfectados e não infectados. Houve diferença significativa (P<0,05) apenas quando comparados os grupos infectados ao controle não infectado, não tendo sido ainda um antígeno espécie-específico. |
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Hélida Monteiro de Andradehttp://lattes.cnpq.br/9446050242071321Simone da Fonseca PiresRoberta Lima CaldeiraAlexandre Barbosa ReisDaniel Moreira de AvelarDaniella Castanheira BartholomeuWagner Luiz Tafurihttp://lattes.cnpq.br/0956543496382057Jordanna Luíza de Lima Celeste2021-03-26T14:23:37Z2021-03-26T14:23:37Z2019-03-20http://hdl.handle.net/1843/35441A ampla distribuição e sobreposição de espécies de Leishmania e de diferentes formas clínicas das leishmanioses no país podem afetar diretamente o curso clínico da doença, diagnóstico, controle e tratamento. Com isso, o desenvolvimento de métodos de diagnóstico espécie-específicos e que possam ser utilizados na rotina são necessários e de grande importância. No Brasil, a espécie Leishmania amazonensis é agente etiológico principalmente da forma cutânea da doença, mas já foi também encontrada promovendo doença visceral em humanos e cães. Além disso, sua coexistência com outras espécies do parasito, como L. infantum, agente etiológico da leishmaniose visceral, torna de suma importância a identificação da espécie durante o diagnóstico da infecção por Leishmania spp. Para isso, no presente trabalho, como teste molecular, padronizamos a técnica de LAMP (Amplificação Isotérmica Mediada por Loop), a partir do desenho e utilização de iniciadores específicos para L. amazonensis com visualização do resultado utilizando gel de poliacrilamida e detecção colorimétrica (SYBR® Safe). A reação apresentou 100% de especificidade quando comparado as espécies L. infantum, L. braziliensis, L. major, L. mexicana, L. donovani, L. guyanensis, Trypanosoma cruzi, Babesia canis e Toxoplasma gondii e quando testado diferentes cepas de L. amazonensis. O limite de detecção da reação foi de 10pg de DNA de L. amazonensis. Apresentou 89% de sensibilidade quando comparada a PCR convencional utilizando amostras de DNA de pele de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis (n=9), L. infantum (n=9) e coinfecção (n=9). Para o desenvolvimento de um teste sorológico, foi realizada uma abordagem imunoproteômica para seleção de proteínas antigênicas espécie-específicas, para isso, utilizamos extrato proteico de L. amazonensis fracionados em eletroforese bi-dimensional (2-DE) associados a western blot (WB) com pool de soros de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis e L. infantum. A sobreposição entre as imagens de gel 2-DE e membranas de WB permitiu a seleção de 8 spots reativos somente a soros de animais infectados com L. amazonensis e não reativos a soros de infectados com L. infantum ou de não infectados. Foram identificadas duas proteínas em 6/8 spots. Uma delas, a HSP70, produzida de forma recombinante foi utilizada como antígeno em um teste de ELISA com pool de soros de hamsters infectados com L. amazonensis, L. infantum, coinfectados e não infectados. Houve diferença significativa (P<0,05) apenas quando comparados os grupos infectados ao controle não infectado, não tendo sido ainda um antígeno espécie-específico.The wide distribution and overlapping of Leishmania species and different clinical forms of leishmaniasis in the country can directly affect the clinical course of the disease, diagnosis, control and treatment. Thereby, the development of species-specific diagnostic methods that can be used routinely are necessary and of great importance. In Brazil, Leishmania amazonensis is an etiological agent mainly of the cutaneous form of the disease, but has already been found promoting visceral disease in humans and dogs. In addition, its coexistence with other species of the parasite, such as L. infantum, etiological agent of visceral leishmaniasis, makes it very important to identify the species during the diagnosis of Leishmania spp. For this, in the present work, as molecular test, we standardized the LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) technique, with the design and use of specific primers for L. amazonensis and visualization of the result using polyacrylamide gel and colorimetric detection (SYBR® Safe). The reaction showed 100% specificity when compared L. infantum, L. braziliensis, L. major, L. mexicana, L. donovani, L. guyanensis, Trypanosoma cruzi, Babesia canis and Toxoplasma gondii species and when tested different strains of L. amazonensis. The detection limit of the reaction was 10pg of L. amazonensis DNA. It presented 89% sensitivity when compared to conventional PCR using hamster skin DNA samples experimentally infected with L. amazonensis (n=9), L. infantum (n=9) and coinfection (n=9). For the development of a serological test, an immunoproteomic approach was used to select species-specific antigenic proteins. For this, we used protein extract of L. amazonensis fractionated in bi-dimensional electrophoresis (2-DE) and western blot (WB) with pool of hamster sera experimentally infected with L. amazonensis and L. infantum. The overlap between 2-DE gel images and WB membranes allowed the selection of 8 spots reactive only to sera from animals infected with L. amazonensis and not reactive to sera from L. infantum or uninfected. Two proteins were identified in 6/8 spots. One of them, the recombinantly produced HSP-70 was used as an antigen in an ELISA test with pool of hamsters sera infected with L. amazonensis, L. infantum, coinfected and uninfected. There was a significant difference (P<0.05) only when the infected groups were compared to the uninfected control, not being a species-specific antigen.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas GeraisCAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorporUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em ParasitologiaUFMGBrasilICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAShttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/info:eu-repo/semantics/openAccessLeishmaniaLeishmanioseLeishmaniose visceralDiagnósticoDiagnóstico específicoImunoproteômicaLAMPLeishmania amazonensisDesenvolvimento de métodos moleculares e sorológicos para diagnóstico específico de infecções por Leishmania (Leishmania) amazonensisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALTese Jordanna versão final.pdfTese Jordanna versão final.pdfapplication/pdf3097847https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/35441/1/Tese%20Jordanna%20vers%c3%a3o%20final.pdfc5043f3a31825ba467433cce42e88fd5MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/35441/2/license_rdfcfd6801dba008cb6adbd9838b81582abMD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82119https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/35441/3/license.txt34badce4be7e31e3adb4575ae96af679MD531843/354412021-03-26 11:23:37.788oai:repositorio.ufmg.br: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Repositório de PublicaçõesPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2021-03-26T14:23:37Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false |
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