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Maria de Fátima Martins Hortahttp://lattes.cnpq.br/6431550513796092Glória Regina FrancoCarlos Renato MachadoRicardo FujiwaraLuíz Carlos Crocco AfonsoWanderson Duarte da Rochahttp://lattes.cnpq.br/0740673738822247Natália Tomich de Paiva Miranda2021-01-12T15:18:28Z2021-01-12T15:18:28Z2016-04-28http://hdl.handle.net/1843/34675CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoCAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorTrabalhos anteriores de nosso grupo demostraram que promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis possuem uma citolisina capaz de lisar eritrócitos e macrófagos, a qual chamamos de leishporina, devido ao seu mecanismo de lise ser por formação de poros na membrana de macrófagos. Embora a leishporina já tenha sido caracterizada por nós sob diversos aspectos bioquímicos, sua identidade molecular é ainda desconhecida. Uma vez que o genoma da L. major já foi completamente sequenciado, iniciamos nosso trabalho buscando por genes que pudessem codificar proteínas que tivessem atividade citolítica e ser responsável pela atividade da leishporina. Nossas pesquisas no banco de dados tritrypDB, revelaram a existência de 3 genes anotados como hemolisinas do tipo III putativas denominados LmjF36.5500, LmjF36.5510, LmjF36.5520. Estas sequências mostraram uma homologia significativa com outras hemolisinas do tipo III formadoras de poros e já caracterizadas em outros organismos. Mostramos por PCR em tempo real que 2 destes genes são expressos em promastigotas na fase estacionária, fase em que a expressão da atividade da leishporina é máxima. Quando comparamos a expressão destes mRNAs entre promastigotas e amastigotas, verificamos que o mRNA do gene Lm5500 é mais expresso em amastigotas, enquanto que para o mRNA de Lm5520 parece não haver diferenças significativas, como demonstrado por PCR em tempo real e Northern blot. Não detectamos mRNA para o gene Lm5510, o que sugere que este gene é pouco/ou não expresso. A fim de determinar a localização subcelular destas proteínas, anticorpos policlonais foram produzidos em camundongos BALB/c e utilizados em microscopia de imunofluorescência confocal. Aparentemente, a proteína codificada pelo gene LmjF36.5520 se localiza em uma estrurura alongada e única, que aparenta ser o Túbulo Multivesicular (MVT), que se estende do bolso flagelar até a extremidade posterior do parasito. A proteína codificada pelo gene LmjF36.5500 está localizada em estruturas que se assemelham aos acidodocalcissomos. Confirmando os resultados PCR em tempo real, não foi possível detectar a fluorescência para a proteína codificada pelo gene Lmjf36.5510. Parasitas superexpressores das proteínas Lm5500 e Lm5520 foram gerados para avaliarmos o fenótipo lítico dos mesmos. Nossos resultados demonstram que os clones que superexpressam as proteínas Lm5500 e Lm5520 têm sua atividade litica aumentada em relação aos mock transfectados. Esse resultado indica que esas proteínas são potencialmente candidatas a codificarem a leishporina ou a uma proteína importante para a ação da leishporina.porUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Bioquímica e ImunologiaUFMGBrasilICB - DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIAhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/info:eu-repo/semantics/openAccessBiologia molecularLeishmaniaLeishmania majorBioquímicaImunologiaCaracterização e estudo funcional dos genes anotados como hemolisinas do tipo III em Leishmania major.info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALTESE FINAL NATÁLIA.pdfTESE FINAL NATÁLIA.pdfapplication/pdf2914814https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/34675/1/TESE%20FINAL%20NAT%c3%81LIA.pdf5daddb48b8233c5726ff274201d67608MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/34675/2/license_rdfcfd6801dba008cb6adbd9838b81582abMD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82119https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/34675/3/license.txt34badce4be7e31e3adb4575ae96af679MD531843/346752021-01-12 12:18:28.858oai:repositorio.ufmg.br:1843/34675TElDRU7Dh0EgREUgRElTVFJJQlVJw4fDg08gTsODTy1FWENMVVNJVkEgRE8gUkVQT1NJVMOTUklPIElOU1RJVFVDSU9OQUwgREEgVUZNRwoKQ29tIGEgYXByZXNlbnRhw6fDo28gZGVzdGEgbGljZW7Dp2EsIHZvY8OqIChvIGF1dG9yIChlcykgb3UgbyB0aXR1bGFyIGRvcyBkaXJlaXRvcyBkZSBhdXRvcikgY29uY2VkZSBhbyBSZXBvc2l0w7NyaW8gSW5zdGl0dWNpb25hbCBkYSBVRk1HIChSSS1VRk1HKSBvIGRpcmVpdG8gbsOjbyBleGNsdXNpdm8gZSBpcnJldm9nw6F2ZWwgZGUgcmVwcm9kdXppciBlL291IGRpc3RyaWJ1aXIgYSBzdWEgcHVibGljYcOnw6NvIChpbmNsdWluZG8gbyByZXN1bW8pIHBvciB0b2RvIG8gbXVuZG8gbm8gZm9ybWF0byBpbXByZXNzbyBlIGVsZXRyw7RuaWNvIGUgZW0gcXVhbHF1ZXIgbWVpbywgaW5jbHVpbmRvIG9zIGZvcm1hdG9zIMOhdWRpbyBvdSB2w61kZW8uCgpWb2PDqiBkZWNsYXJhIHF1ZSBjb25oZWNlIGEgcG9sw610aWNhIGRlIGNvcHlyaWdodCBkYSBlZGl0b3JhIGRvIHNldSBkb2N1bWVudG8gZSBxdWUgY29uaGVjZSBlIGFjZWl0YSBhcyBEaXJldHJpemVzIGRvIFJJLVVGTUcuCgpWb2PDqiBjb25jb3JkYSBxdWUgbyBSZXBvc2l0w7NyaW8gSW5zdGl0dWNpb25hbCBkYSBVRk1HIHBvZGUsIHNlbSBhbHRlcmFyIG8gY29udGXDumRvLCB0cmFuc3BvciBhIHN1YSBwdWJsaWNhw6fDo28gcGFyYSBxdWFscXVlciBtZWlvIG91IGZvcm1hdG8gcGFyYSBmaW5zIGRlIHByZXNlcnZhw6fDo28uCgpWb2PDqiB0YW1iw6ltIGNvbmNvcmRhIHF1ZSBvIFJlcG9zaXTDs3JpbyBJbnN0aXR1Y2lvbmFsIGRhIFVGTUcgcG9kZSBtYW50ZXIgbWFpcyBkZSB1bWEgY8OzcGlhIGRlIHN1YSBwdWJsaWNhw6fDo28gcGFyYSBmaW5zIGRlIHNlZ3VyYW7Dp2EsIGJhY2stdXAgZSBwcmVzZXJ2YcOnw6NvLgoKVm9jw6ogZGVjbGFyYSBxdWUgYSBzdWEgcHVibGljYcOnw6NvIMOpIG9yaWdpbmFsIGUgcXVlIHZvY8OqIHRlbSBvIHBvZGVyIGRlIGNvbmNlZGVyIG9zIGRpcmVpdG9zIGNvbnRpZG9zIG5lc3RhIGxpY2Vuw6dhLiBWb2PDqiB0YW1iw6ltIGRlY2xhcmEgcXVlIG8gZGVww7NzaXRvIGRlIHN1YSBwdWJsaWNhw6fDo28gbsOjbywgcXVlIHNlamEgZGUgc2V1IGNvbmhlY2ltZW50bywgaW5mcmluZ2UgZGlyZWl0b3MgYXV0b3JhaXMgZGUgbmluZ3XDqW0uCgpDYXNvIGEgc3VhIHB1YmxpY2HDp8OjbyBjb250ZW5oYSBtYXRlcmlhbCBxdWUgdm9jw6ogbsOjbyBwb3NzdWkgYSB0aXR1bGFyaWRhZGUgZG9zIGRpcmVpdG9zIGF1dG9yYWlzLCB2b2PDqiBkZWNsYXJhIHF1ZSBvYnRldmUgYSBwZXJtaXNzw6NvIGlycmVzdHJpdGEgZG8gZGV0ZW50b3IgZG9zIGRpcmVpdG9zIGF1dG9yYWlzIHBhcmEgY29uY2VkZXIgYW8gUmVwb3NpdMOzcmlvIEluc3RpdHVjaW9uYWwgZGEgVUZNRyBvcyBkaXJlaXRvcyBhcHJlc2VudGFkb3MgbmVzdGEgbGljZW7Dp2EsIGUgcXVlIGVzc2UgbWF0ZXJpYWwgZGUgcHJvcHJpZWRhZGUgZGUgdGVyY2Vpcm9zIGVzdMOhIGNsYXJhbWVudGUgaWRlbnRpZmljYWRvIGUgcmVjb25oZWNpZG8gbm8gdGV4dG8gb3Ugbm8gY29udGXDumRvIGRhIHB1YmxpY2HDp8OjbyBvcmEgZGVwb3NpdGFkYS4KCkNBU08gQSBQVUJMSUNBw4fDg08gT1JBIERFUE9TSVRBREEgVEVOSEEgU0lETyBSRVNVTFRBRE8gREUgVU0gUEFUUk9Dw41OSU8gT1UgQVBPSU8gREUgVU1BIEFHw4pOQ0lBIERFIEZPTUVOVE8gT1UgT1VUUk8gT1JHQU5JU01PLCBWT0PDiiBERUNMQVJBIFFVRSBSRVNQRUlUT1UgVE9ET1MgRSBRVUFJU1FVRVIgRElSRUlUT1MgREUgUkVWSVPDg08gQ09NTyBUQU1Cw4lNIEFTIERFTUFJUyBPQlJJR0HDh8OVRVMgRVhJR0lEQVMgUE9SIENPTlRSQVRPIE9VIEFDT1JETy4KCk8gUmVwb3NpdMOzcmlvIEluc3RpdHVjaW9uYWwgZGEgVUZNRyBzZSBjb21wcm9tZXRlIGEgaWRlbnRpZmljYXIgY2xhcmFtZW50ZSBvIHNldSBub21lKHMpIG91IG8ocykgbm9tZXMocykgZG8ocykgZGV0ZW50b3IoZXMpIGRvcyBkaXJlaXRvcyBhdXRvcmFpcyBkYSBwdWJsaWNhw6fDo28sIGUgbsOjbyBmYXLDoSBxdWFscXVlciBhbHRlcmHDp8OjbywgYWzDqW0gZGFxdWVsYXMgY29uY2VkaWRhcyBwb3IgZXN0YSBsaWNlbsOnYS4KCg==Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2021-01-12T15:18:28Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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