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Elio Anthony Cinohttp://lattes.cnpq.br/0271206558713652Adolfo Henrique de Moraes SilvaLiza Figueiredo Felicori VilelaLucas Bleicherhttp://lattes.cnpq.br/6601840765664681Veronica Silva Valadares2023-05-26T16:16:13Z2023-05-26T16:16:13Z2020-02-28http://hdl.handle.net/1843/53996https://orcid.org/0000-0003-1931-3464Tetracenomycin aromatase/cyclase (Tcm) is an enzyme derived from Streptomyces glaucescens involved in polyketide cyclization, aromatization, and folding. Polyketides are a diverse class of secondary metabolites produced by certain groups of bacteria, fungi, and plants with pharmaceutical applications. Examples include antibiotics, such as tetracycline, and anticancer drugs, such as doxorubicin. The N-terminal domain of Tcm (TcmN) participates in the specific cyclization of polyketides, and is classified as belonging to the Bet v 1-like superfamily. TcmN catalyzes the formation of the first (C9-C142) and second (C7-C16) rings of polyketides in vivo and in vitro. This work characterized the stability and conformational diversity TcmN, which is important for its possible use in industrial applications, such as engineering polyketide biosynthesis. TcmN was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) and purified. Secondary structure and stability were assessed in different buffer conditions by circular dichroism (CD) and fluorescence spectroscopy. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectra were acquired at different field strengths (900, 800, and 600 MHz). 6 x 1 μs Molecular Dynamics (MD) simulations of TcmN were performed in explicit solvent. Thermal denaturation of TcmN is irreversible, and the denaturation temperature is reduced at higher concentrations. TcmN is most stable around pH 8, and in the presence of NaI and NaCl. NMR and MD findings suggest that substrate binding and product release can be modulated by flexibility of specific loop segments. Together, the results indicate that TcmN exists in equilibrium between an open conformation that favors ligand binding in the main hydrophobic cavity, and a closed state that protects it against solvent exposure and aggregation.A tetracenomicina aromatase/ciclase (Tcm) é uma enzima presente em Streptomyces glaucescens envolvida na ciclização, aromatização e enovelamento de policetídeos. Os policetídeos são uma classe diversificada de metabólitos secundários produzidos por certos grupos de bactérias, fungos e plantas, com aplicações farmacêuticas. Exemplos incluem antibióticos, como a tetraciclina, e drogas anticâncer, como a doxorrubicina. O domínio N-terminal da Tcm (TcmN) participa de ciclizações específicas de policetídeos e é classificada como pertencente à superfamília Bet v 1. A TcmN catalisa a formação do primeiro (C9-C14) e segundo (C7-C16) anéis de policetídeos in vivo e in vitro. Este trabalho caracterizou a estabilidade e a diversidade conformacional da TcmN, informações importantes para o possível uso da TcmN em aplicações industriais, como na engenharia da biossíntese de policetídeos. A TcmN foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) e purificada. Sua estrutura secundária e estabilidade foram avaliadas em diferentes condições de tampão por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram adquiridos em espectrômetros de diferentes campos magnéticos (900, 800 e 600 MHz). 6 x 1 μs de simulações de Dinâmica Molecular da TcmN foram realizadas em solvente explícito. A desnaturação térmica da TcmN é irreversível e a temperatura de desnaturação é reduzida em concentrações mais altas da proteína. A TcmN é mais estável em torno de pH 8 e na presença de NaI e NaCl. Os resultados de ressonância magnética nuclear e de dinâmica molecular sugerem que a ligação do substrato e a liberação do produto podem ser moduladas pela flexibilidade de algumas alças. Juntos, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que a TcmN existe em equilíbrio entre a conformação aberta, que favorece a ligação do ligante na cavidade hidrofóbica, e um principal estado fechado, que o protege a cavidade contra a exposição de solventes e à agregação.FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas GeraisFINEP - Financiadora de Estudos e Projetos, Financiadora de Estudos e ProjetosengUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Bioquímica e ImunologiaUFMGBrasilICB - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAShttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/info:eu-repo/semantics/openAccessBioquímicaAromataseCiclizaçãoPolicetídeosTetraciclinaTetracenomycinTcmNaromatasecyclaseARO/CYCNMRpolyketidescyclizationaromatizationBiophysical characterization of the N-terminal domain of Tetracenomycin ARO/CYCCaracterização biofísica do domínio N-terminal da Tetracenomicina ARO/CYCinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINAL2020Mestrado_VeronicaSValadares.pdf2020Mestrado_VeronicaSValadares.pdfapplication/pdf4275979https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/53996/1/2020Mestrado_VeronicaSValadares.pdfc1edc3141bfe2cebe0a4c6f8908065d2MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/53996/2/license_rdfcfd6801dba008cb6adbd9838b81582abMD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82118https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/53996/3/license.txtcda590c95a0b51b4d15f60c9642ca272MD531843/539962023-05-26 13:16:13.761oai:repositorio.ufmg.br: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2023-05-26T16:16:13Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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