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Ricardo Toshio FujiwaraDeborah Aparecida Negrao CorreaPedro Henrique Gazzinelli Guimaraes2019-08-13T20:02:23Z2019-08-13T20:02:23Z2010-10-29http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8EMKEFA ancilostomíase é uma das doenças parasitárias crônicas de maior prevalência no mundo, com uma estimativa entre 576 e 740 milhões de indivíduos infectados. Estudos da biologia do parasito demonstraram que os ancilostomídeos conseguem sobreviver em seus hospedeiros por vários anos, mesmo diante uma resposta imune robusta, o que representa um forte indicativo da evasão imunológica pelo parasito. Entretanto, devido à escassez de trabalhos voltados para o estudo da resposta celular na ancilostomíase humana e experimental, os mecanismos de evasão desencadeados pelos produtos de excreção/secreção (ES) do parasito, dentre eles a indução de apoptose das células reativas do hospedeiro, não foram ainda completamente elucidados. No presente estudo, avaliou-se, por meio da técnica de MTT e HFS, a viabilidade celular e a fragmentação do DNA respectivamente, de células Jurkat e linfócitos de linfonodos mesentéricos de hamsters infectados por ancilostomídeos e não infectados, após estímulo com diferentes concentrações do antígeno excretado/secretado (ES) e bruto (HEX) de vermes adultos de Ancylostoma ceylanicum. Além disso, avaliamos por citometria de fluxo, através da marcação celular com anexina V e iodeto de propídeo (PI), o perfil apoptótico da população de linfócitos totais e subpopulações CD4+, CD8+ e CD19+ de pacientes infectados por ancilostomídeos e indivíduos não infectados. Por fim, avaliamos por meio da técnica de PCR em tempo real, a expressão de diferentes genes associados com as prováveis vias apoptóticas que estariam sendo ativadas ou moduladas nas células Jurkat pelos antígenos do parasito. Nossos resultados demonstraram uma diminuição significativa no percentual de viabilidade das células Jurkat assim como das células de linfonodos mesentéricos de hamsters controles e infectados, estimuladas com antígenos do parasito, principalmente o antígeno ES, nas concentrações de 50 e 100 g/mL, quando comparadas com células não estimuladas. Além disso, a análise do ensaio de HFS demonstrou um aumento significativo no percentual de células Jurkat e linfócitos de linfonodos mesentéricos de hamsters controles e infectados, com DNA fragmentado, após estímulo com antígenos ES, quando comparado com as células não estimuladas. A análise da marcação celular com Anexina V e PI demonstrou que os pacientes infectados por ancilostomídeos apresentam um aumento do número de linfócitos CD4+, CD8+ e CD19+ em processo de apoptose, quando comparados com indivíduos do grupo controle. A regulação negativa da expressão dos receptores de morte celular da superfamília TNF, assim como a regulação positiva dos genes pró-apoptóticos, associados a família BCL-2, e a família P53, observados pela qPCR, sugere que os antígenos de A. ceylanicum estariam induzindo apoptose celular pela via intrínseca mitocondrial. A partir destes resultados, podemos inferir que os antígenos de A. ceylanicum apresentam um potencial efeito citotóxico e pró-apoptótico para a população de linfócitos T CD4+ e CD8+ e linfócitos B, atuando principalmente no controle do número absoluto e na capacidade proliferativa destas células, contribuindo para modulação da resposta imunológica, e consequentemente, para a sobrevivência do parasito em seu hospedeiro.Hookworm infection is one of the most prevalent parasitic diseases, infecting an estimated 740 million people in tropical and subtropical regions of the world. A robust but ineffective immune response, characterized by the ablation of parasite-specific T cell proliferative response (hyporesponsiveness), is often observed in the hookworm infection resulting in a long term parasite survival in the host lumen. While several mechanisms of modulation have been demonstrated for hookworm and other neglected tropical infections, the influence of apoptosis into the immunomodulation of hookworm infection is still poorly understood. In the current study, MTT assay for cell viability, of Jurkat T cells and mesenteric lymph nodes cells from infected and non-infected hamsters was performed in the presence of different concentrations of adult Ancylostoma ceylanicum excreted/secreted products (ES) and crude extract (HEX) (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 g/mL). Besides that we evaluated the DNA fragmentation, using a hypotonic fluorocromic solution (HFS), in Jurkat T cells and mesenteric lymph nodes cells from infected and non-infected hamsters, after ES and HEX stimulation. Moreover, the phenotypic profile of circulating lymphocytes from Necator americanus infected and healthy non-infected donors were evaluated by flow cytometry using Annexin V-FITC and Propidium Iodide (PI) staining. Finally, we evaluated by Real Time PCR, the expression of 84 genes related with different apoptotic pathways, after hookworms antigens stimulation. Our results demonstrated that stimulation of Jurkat T cells with ES and HEX antigen induced a decrease of cell viability in a dose-dependent manner when compared with control non-stimulated cells. Similarly, decrease of cell viability of lymph nodes cells after antigenic stimulation was also observed in both infected and non-infected groups. The analysis of HFS assay showed that the stimulation with hookworm ES antigen induced an increase of DNA fragmentation in Jurkat T cells (p=0,0001) as well as in mesenteric lymph nodes cells from infected (p=0,0073) and non-infected hamsters (p<0.0001), when compared with non-stimulated cells. Flow cytometric analysis demonstrated that hookworm infected patients presented a significant increase of early apoptotic CD4+ , CD8+ , and CD19+ lymphocytes (Annexin V-FITC+ ) (p=0.0052, p=0.0269 and p< 0.0001, respectively) and also in the late apoptotic CD8+ and CD19+ lymphocytes (Annexin V-FITC+ /PI+ ) (p=0.0248 and p=0.0065, respectively) when compared with non-infected individuals. The down-modulation of the members of the TNF receptor superfamily (death receptors), as well as the up-regulation of the pro-apoptotic genes belonging the BCL-2 and P53 family, observed by qPCR analysis, suggest that hookworms antigens induce apoptosis by intrinsic mitochondrial pathway. In conclusion, this study demonstrated the potential cytotoxic and pro-apoptotic activity of the hookworms` antigens for T and B cells, which contribute to the downmodulation of immune response and the survival of the hookworms in their hosts.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGResposta imuneParasitologiaAncilostomiaseHelmintologiaApoptoseParasitologiaAtividade citotóxica e pró-apoptótica de antígenos de ancylostoma ceylanicum: Implicações na modulação da resposta imune na ancilostomíaseinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALpedro_henrique_gazzinelli___disserta__o_de_mestrado.pdfapplication/pdf1359593https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-8EMKEF/1/pedro_henrique_gazzinelli___disserta__o_de_mestrado.pdf8790a51db9133d26ca411e8cc88c1279MD51TEXTpedro_henrique_gazzinelli___disserta__o_de_mestrado.pdf.txtpedro_henrique_gazzinelli___disserta__o_de_mestrado.pdf.txtExtracted texttext/plain201033https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-8EMKEF/2/pedro_henrique_gazzinelli___disserta__o_de_mestrado.pdf.txte4f3d9c50c8caeca80e083ae491a2f78MD521843/BUOS-8EMKEF2019-11-14 15:22:45.625oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUOS-8EMKEFRepositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T18:22:45Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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