Caracterização cinética da inibição da calicreína tecidual do rato, isolada da glândula submandibular, com a aprotinina

• Autor(a) principal: Carolina Matias Diniz
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/NCFA-7NPK27
• topic: Cinética enzimática; Aprotinina; Calicreína tecidual de rato; Inibição da calicreína tecidual do rato; Bioquímica; Calicreína; Farmácia; Glândula submandibular

As calicreínas são um sub-grupo da família das serino-proteases conhecidas por apresentarem importantes funções fisiológicas dependentes dos tecidos e das circunstâncias de expressão. Elas são encontradas no pâncreas, glândulas salivares, intestinos, rins, glândula pituitária, plasma, soro e outros tecidos. Evidências sugerem que as calicreínas teciduais estão envolvidas em diferentes processos patológicos, incluindo doenças no Sistema Nervoso Central, tais como epilepsia, Alzheimer e câncer, sendo, portanto, futuras candidatas a marcadores tumorais em diferentes órgãos. O objetivo deste trabalho foi a purificação da calicreína tecidual do rato (rK1), isolada da glândula submandibular, a caracterização cinética da sua inibição pela aprotinina e a comparação dos resultados obtidos com dados publicados na literatura. A rK1 foi purificada a partir do pó liofilizado de 300 glândulas submandibulares de ratos Wistar adultos rK1. A purificação constou de: preparação do extrato bruto, seguida de três cromatografias, a saber: cromatografia de troca iônica em coluna de DEAESepharose, cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-aprotinina ecromatografia de filtração molecular em coluna de Superose 12 HR 10/30 em equipamento FPLC. Proteínas foram dosadas segundo Bradford, 1976 e a atividade amidásica foi determinada com o substrato Bz-Arg-Nan, segundo Erlanger et al., 1961. O fator de purificação foi de 32 vezes e o rendimento foi de 5%. Como critérios de pureza, foram realizadas a eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente 5-15% e SDS 0,1% e a espectrometria de massa. A massa molecular da rK1 foi de 28 kDa. A titulação da solução da rK1 purificada com a aprotinina revelou uma concentração de 692 nM, em centro ativo. A18 hidrólise do substrato D-Val-Leu-Arg-Nan, catalisada pela rK1, em pH 9,0, 37oC, foi estudada na ausência e na presença de concentrações crescentes de aprotinina. Os resultados mostraram que a hidrólise seguiu à cinética de Michaelis-Menten na faixa de concentrações do substrato utilizadas (120 a 640 mM). Os valores calculados de Km e kcat foram 104,2 + 24,6 mM e 8641 + 572 min-1, respectivamente. A inibição da rK1 pela aprotinina é competitiva parabólica, um tipo raro de inibição, onde duas moléculas de aprotinina se ligam a uma moléculada enzima. Os valores calculados de Ki e Kii foram 26,4 + 12 nM e 16,9 8,8 nM, respectivamente. A inibição da hK1 pela aprotinina, com o substrato D-Val-Leu-Arg-Nan, é competitiva parabólica e, portanto, semelhante à inibição da calicreína tecidual humana (hK1) com o mesmo substrato.