Resposta diferencial de células mononucleares do sangue periférico de indivíduos epiléticos e não epiléticos a estímulo inflamatório

• Autor(a) principal: Flavia Mendes Amaral
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-AJ4PHX
• topic: Epilepsia; Imunidade; Citocinas; Inflamação; Neurociências

Epilepsia é considerada uma predisposição permanente para geração de crises convulsivas, com a presença de disfunção cognitiva e emocional do indivíduo, sendo uma das desordens neurológicas mais comuns em todo o mundo, afetando 1% da população mundial. O papel da inflamação na epilepsia humana foi primeiramente investigado através do tratamento com esteroides e outros anti-inflamatórios, quemostraram uma ação anticonvulsivante em alguns casos de epilepsia resistente ao tratamento convencional. Evidências sugerem a ativação da imunidade inata e adaptativa na epilepsia humana, sugerindo também que a inflamação pode contribuir para geração e recorrência de crises e dano neuronal, por outro lado, as crises epiléticas recorrentespodem perpetuar a resposta inflamatória, o que leva a uma inflamação crônica. Apesar disso, ainda não é claro se a produção de mediadores inflamatórios por células imune de pacientes portadores de epilepsia diferem das de indivíduos saudáveis. Desta forma, o presente estudo pretendeu testar a hipótese de que existe uma desregulação em vias desinalização de células mononucleares periféricas de pacientes com ELT, o que contribui para um padrão de resposta diferencial em relação aos indivíduos controles frente a um estímulo inflamatório. Métodos: Os experimentos foram realizados em indivíduos com Epilepsia do Lobo Temporal com e em indivíduos saudáveis, entre 18 e 65 anos, queaceitaram participar da pesquisa, assinando o Termo de Consentimento Livre e esclarecido (TCLE). Os indivíduos que aceitaram participar do estudo e que preenchiam os critérios estabelecidos pela pesquisa foram submetidos a uma breve anamnese e coleta de dados sócio-demográficos, aferição de peso e altura, aplicação do questionário para avaliação de sintomas ansiosos e depressivos (HAD) e coleta do material biológico (sangue periférico). O sangue periférico foi recolhido em tubos a vácuo contendo heparina sódica e foi realizado o protocolo de Obtenção de Células Mononucleares do SanguePeriférico (CMSP). Após a contagem das células, foi realizado o plaqueamento e as células foram submetidas à cultura na presença ou ausência dos bloqueadores das enzimas PI3K, PI3Kg, mTOR e GSK3 por uma hora, em estufa de CO2 (37ºC). Após essa breve incubação, adicionou-se PHA aos poços estimulados ou RPMI aos poços semestímulos. As células foram então incubadas por 24 horas em estufa de CO2. Após a incubação, separou-se o sobrenadante das culturas e estes foram armazenados em freezer -20ºC até o momento das análises. As dosagens de citocinas e quimiocinas do sobrenadante das culturas e plasma dos indivíduos com ELT e controles foram realizadaspelo método de CBA, conforme instruções do fabricante (BD Bioscience, San Diego, CA, USA). Utilizaram-se os kits para quantificação de proteínas inflamatórias (Human Inflammation - IL-1, IL-6, IL-10, TNF e IL-12p70). A análise estatística foi realizada utilizando o programa estatístico Prisma 5.0 (GraphPad, CA, USA) e os dados foramapresentados como média ± erro-padrão da média (E.P.M.). O nível de significância foi estabelecido em p<0,05. Resultados: A inibição de todas as isoformas de PI3K ou a inibição seletiva de PI3Kg, assim como a inibição de mTOR aumentou os níveis de, IL-6 e IL-8 apenas em células de controles não estimuladas. Por outro lado, os inibidores nãoalteraram significativamente os níveis das células estimuladas com PHA. A inibição de todas as isoformas de PI3K ou a inibição seletiva de PI3Kg, assim como a inibição de mTOR e GSK3 resultou em uma diminuição nos níveis de TNF e IL-10 em células de pacientes com ELT estimuladas com PHA, com exceção da inibição de GSK3 para IL-10.Demonstramos ainda que PHA aumentou os níveis de IL-12p70 somente em células de pacientes e a inibição de PI3K e mTOR exacerbou o efeito de PHA somente nas células dos pacientes. A inibição seletiva da isoforma da PI3K não alterou os níveis de IL-12p70.Conclusão: No presente estudo demonstramos que a produção de citocinas por células imunes de pacientes com ELT é controlada de maneira diferenciada das células de controles saudáveis. Essa regulação diferencial pode ser dependente da atividade dediferentes moléculas intracelulares, tais como a via PI3K, mTOR e GSK-3. Esta diferente resposta a estímulos inflamatórios e uma alteração nas vias que controlam a produção de mediadores inflamatórios pode contribuir para a fisiopatogênese das epilepsias.