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Carlos Renato Machadohttp://lattes.cnpq.br/6306925202374274Carlos Frederico Martins MenckAndrea Rodrigues AvilaLucymara Fassarella AgnezMariana Torquato Quezado de Magalhãeshttp://lattes.cnpq.br/1164415519127423Willian dos Reis Bertoldo2023-03-15T16:55:40Z2023-03-15T16:55:40Z2021-11-03http://hdl.handle.net/1843/50920O estresse transcricional que leva à parada da RNA polimerase pode ser causado por danos ao DNA. A RNA polimerase paralisada é um importante sinal para iniciar o reparo acoplado à transcrição (TC-NER). Previamente demonstramos que altas doses de UV matam o Trypanosoma cruzi rapidamente, as lesões de DNA geradas no genoma nuclear do parasito podem ser persistentes. Além disso, os estudos de TcCSB, a proteína chave no reconhecimento da RNA polimerase paralisada, indicaram que essa proteína é importante para o parasito lidar com os danos ao DNA. A superexpressão de TcCSB aumentou a sensibilidade das células à luz UV de modo dependente das cinases ATM/ATR. Por outro lado, as células heminocaute de TcCSB mostraram ser resistentes à UV. Esses resultados sugerem que o bloqueio da transcrição é um estímulo para desencadear um mecanismo de morte sinalizada em T. cruzi. Logo, um dos objetivos deste trabalho em T. cruzi foi verificar se o bloqueio da transcrição após danos por UV é a principal causa da morte, para isso, as células foram pré-tratadas com α-amanitina e desafiadas com UV (1.500 J/m2). Ademais, para investigar se a sensibilidade a UV é dependente da fase do ciclo celular, as células foram sincronizadas com hidroxiuréia (20 mM) e o ciclo celular determinado por FACS, em seguida as células foram desafiadas com UV (1.500 J/m2). Visto que, a via de resposta a danos ao DNA (DDR) durante a transcrição resulta da interação com outras proteínas que são mediadoras. Resolvemos investigar o papel das mediadoras TcRPA, TcRNAseH1, TcRNAseH2A, através da superexpressão desses genes e descrevemos o fenótipo dessas linhagens após UV (1.500 J/m2). Por fim, após a obtenção do anticorpo anti-TcCSB, realizamos a imunolocalização da proteína TcCSB após irradiação com a luz UV (500 J/m2). Em nossos resultados observamos que, as células pré-tratadas com um inibidor seletivo da RNA polimerase II, se tornam resistentes à UV, porém, quando esse composto é removido e o processo de transcrição reiniciado, as células tornam-se sensíveis à UV novamente. Ademais, a sobrevivência das células em fases G1 e G2 é afetada após a exposição à luz UV, uma vez que na fase G1 ocorre um aumento da taxa de morte e a fase G2 leva a uma maior sobrevivência do parasito. E demonstramos que, a superexpressão dos genes RPA, RNAseH1 e RNAseH2A está relacionada ao fenótipo de resistência celular após UV. Após a irradiação UV, a proteína TcCSB, até duas horas, foi encontrada concentrada núcleo e no kDNA e em pequenos foci perinucleares. Após quatro horas, TcCSB apresenta uma distribuição granular no citoplasmática, não sendo observada após 24 horas. Esses dados sugerem que a morte observada após a exposição à UV é dependente da paralisação da RNA polimerase em etapa inicial de síntese de mRNA. E que possivelmente a DDR durante a transcrição requer a participação de TcRNApolII, TcCSB e quinases TcATM e TcATR de acordo com as fases do ciclo celular. Como também que, a interação RPA-RNaseH1 e RPA-RNAseH2A seja necessária para prevenir a geração de danos ao DNA associados com a formação de R-loop. Tomado em conjunto, esses dados sugerem que a via TC-NER é importante para a sobrevivência do parasito após UV, de modo a assegurar a manutenção da integridade da transcrição multigênica.Transcriptional stress which leads to RNA polymerase arrest can be caused by damage to the DNA. The stalled RNA polymerase is a significant signal to begin the transcription-coupled repair (TC-NER). Our previous results showed that high doses of UV kill the Trypanosoma cruzi rapidly and demonstrate that DNA lesions caused in the nuclear genome of the parasite can be persistent. In addition, studies of TcCSB, key protein in recognizing the stalled RNA polymerase, show that this protein is important for the parasite to deal with the DNA damage caused by genotoxic agents. Over-expression of TcCSB increased cell sensitivity to UV light in ATM/ATR kinase-dependent manner. On the other hand, TcCSB single-knockout cells showed resistance to UV light. These results suggest that the blockage of transcription is a stimulus to trigger a signaled death mechanism in T. cruzi. One of the objectives of this work was to verify if transcription blockage after UV damage is the principal cause of death, for this, the cells were pre-treated with α-amanitin and challenged with UV (1.500 J/m2). In addition, to investigate whether the sensitivity of T. cruzi to UV light is dependent on the cell cycle phase, the cells were synchronized with hydroxyurea (20mM) and the cell cycle determined by FACS, then, the cells were treated with UV (1.500 J/m²). Since, the DNA damage response pathway (DDR) during transcription results from the interaction with other proteins which are mediators. In this work, we investigated the role of TcRPA, TcRNAseH1, TcRNAseH2A mediators through the overexpression of these genes and we describe the phenotype of these strains after UV (1,500 J/m2). Finally, in this work, after obtaining the anti-TcCSB antibody, we performed the immunolocalization of the protein after irradiation with UV light (500 J/m2). In our results, we observe that cells pre-treated with a selective inhibitor of RNA polymerase II, which showed that these cells become resistant to UV light. However, when this compound was removed and the transcription process re-initiated, the cells went back to being sensitive to UV. Furthermore, our results allow us to conclude that G1 and G2 phases of the cell cycle affect the survival after exposure to UV light since in G1 phase an increase in death level occurs and phase G2 leads to a greater survival of the parasite. After UV irradiation, CSB protein was found concentrated in little foci located around the nucleus and in the kDNA for up to two hours. Differently, four hours after UV irradiation, the CSB protein presents a granular cytoplasmic distribution. Nevertheless, 24 hours after the irradiation, we did not observe any CSB labeling. Taken together, these data suggest that the death observed after exposure UV is dependent on RNA polymerase stalled in the initial phase of synthesis with the participation of TcRNApolII, TcCSB and TcATM and TcATR kinases according to the phase of the cell cycle. As well, it is proposed that the interaction of RPA-RNaseH1 and RPA-RNAseH2A is necessary to prevent causing DNA damage associated to R-loop and cell death. In conclusion, taken together, these data suggest that the TC-NER pathway is important for the parasite survival after UV in a way to ensure the maintenance of multigene transcription integrity.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoporUniversidade Federal de Minas GeraisPrograma de Pós-Graduação em Bioquímica e ImunologiaUFMGBrasilICB - DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIABioquímica e imunologiaTrypanosoma cruziDano ao DNAReparo do DNATranscrição genéticaTrypanosoma cruziProteína CSB (cockayne syndrome type B)Reparo por Excisão de Nucleotídeos Acoplado à TranscriçãoSinalização de Resposta a Danos ao DNADano ao DNAReparo do DNAEstudo dos mecanismos moleculares da via de sinalização à resposta a danos ao DNA relacionada com o reparo acoplado à transcrição em Trypanosoma cruzi.Molecular mechanisms of the DNA damage response signaling pathway related to transcription-coupled repair in Trypanosoma cruzi.info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALBertoldo_Willian_Tese_PGBIQ.pdfBertoldo_Willian_Tese_PGBIQ.pdfTese de Doutorado do aluno Willian Bertoldo - matrícula 2016743470application/pdf6415680https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/50920/1/Bertoldo_Willian_Tese_PGBIQ.pdfb49f8a949921e7d8460c33b4287407b6MD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82118https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/50920/2/license.txtcda590c95a0b51b4d15f60c9642ca272MD521843/509202023-03-15 13:55:41.13oai:repositorio.ufmg.br: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ório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2023-03-15T16:55:41Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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