Ativação da nNOS pela via PKA/PP1: implicações na captação de LDL oxidada via Toll Like Receptor 4

• Autor(a) principal: Juliana María Navia Pélaez
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/35985
• topic: Fisiologia e Farmacologia; Farmacologia; Aterosclerose; Óxido nítrico sintase; Estresse oxidativo; Lipoproteínas LDL

A nNOS tem sido apontada como um fator atero-protetor e sua atividade encontra-se comprometida na hiperlipidemia. No entanto, não é conhecida alguma relação entre os receptores que reconhecem a LDL modificada nos macrófagos com a atividade da nNOS. Assim, neste trabalho avaliamos o papel do NO derivado da nNOS na captação de LDLox e sua relação com a ativação e via de sinalização dos receptores TLR4. Para tal, macrófagos peritoneais de camundongos C57BL/6J e TLR4−/− foram estimulados com LDLox conjugada com FITC por 1h, na presença ou ausência de inibidor da nNOS e/ou amitriptilina (AM; antagonista dos receptores TLR2/4), SNAP(doador de NO) ou H2O2. A LDLox-FITC foi visualizada por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. A produção de NO e superóxido e o influxo de cálcio foi avaliada com as sondas DAF–FM, DHE, Fluo-4 e Fluo-5N. A ativação da nNOS no endotélio foi avaliada em células endoteliais e anéis de aorta estimulados com acetilcolina(Ach). Observou-se que a inibição da nNOS aumentou a captação de LDLox em macrófagos e o doador de NO a diminuiu. Estes efeitos não foram observados quando inibida a polimerização de actina. Além disso, o aumento na captação pela inibição da nNOS foi abolido em animais TLR4−/− e nas células tratadas com AM. Este tratamento, assim como a inibição da nNOS, diminuiu a produção de NO. Os níveis de fosforilação da nNOS (Ser852- inativação) diminuíram ao longo da exposição à LDLox e aumentaram em células TLR4−/− e tratadas com AM. Por outro lado, o estímulo com LDLox levou a liberação de cálcio do retículo de forma dependente do TLR4 pela via da PLC e PKA. A inibição da PKA aumentou a captação de LDLox e diminuiu a produção de NO. Adicionalmente, a inibição da PKA aumentou a fosforilação da nNOS-Ser852 e impediu a translocação de PP1 para o citoplasma. Em células endoteliais e anéis de aorta foi observado desfosforilação do resíduo ser852 pela Acetilcolina. Anéis de aorta silenciados para eNOS mostraram inibição da resposta à acetilcolina quando inibida a PP1. Adicionalmente, evidenciou-se desligamento da PP1 do inibidor endógeno NIPP1 e subsequente translocação ao citoplasma. A estimulação com o análogo do cAMP mimetizou a ativação pela Acetilcolina, e a inibição da PKA impediu a desfosforilação da nNOS-Ser852 e impediu a translocação da PP1. Consequentemente, concluímos que a ativação da nNOS ocorre por um mecanismo dependente da PKA e PP1. Em macrófagos , esta via é induzida pelo estímulo do TLR4 em resposta à LDLox resultando em liberação de NO que possivelmente regula a macropinocitose impedindo ainda maior captação de LDLox.